Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia. Ad esempio, determinare come le proporzioni del sottoinsieme di monociti, o l'espressione di marcatori diversi, vengono alterate negli stati di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica, è che le cellule sono vicine al loro stato nativo, e che vengono utilizzate istruzioni chiare e giustificazione, per fornire un metodo di gating standardizzato.
Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo possono avere difficoltà, perché molti documenti non danno istruzioni chiare su come è stata eseguita la gating delle cellule. Inizia questo protocollo con la raccolta di campioni di sangue e la determinazione del conteggio dei globuli bianchi, come descritto nel protocollo di testo. Diluire il sangue con soluzione salina tamponata da fosfati, per regolare la concentrazione a circa 5 milioni di globuli bianchi per millilitro.
Preparare un mix master sufficiente per il numero di tubi combinando sangue, anti CD14-V450, anti CD16-APC e anti HLA-DR-PerCP. Vortice e pipetta 51,9 microlitri di miscela in ciascun tubo. Aggiungere anticorpi marcatori M1 e M2 etichettati PE, nonché marcatori per cellule T, cellule B, neutrofili e cellule killer naturali ai loro tubi corrispondenti.
Vortice e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Ora, aggiungere 250 microlitri dilisi combinata dei globuli rossi e soluzione di fissaggio dei globuli bianchi e vortice immediatamente la miscela, delicatamente. Incubare la miscela vorticiosa per 10 minuti al buio, a quattro gradi Celsius.
Dopo 10 minuti, aggiungere 250 microlitri di PBS e far girare le celle a 260 g, per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in 300 microlitri di formaldeide all'1%. Conservare le celle a quattro gradi celsius, protette dalla luce fino a quando non viene eseguita l'analisi.
La citometria del flusso deve essere eseguita entro 48 ore dalla preparazione del campione. Per iniziare, controllare il registro del citometro di flusso per assicurarsi che il personale della struttura abbia eseguito controlli di qualità. Per impostare l'esperimento di citometria a flusso, fare clic su un nuovo esperimento, seguito da nuovo campione e nuovo tubo, per aggiungere tubi.
Selezionate i plottamenti bivariati, facendo clic sull'icona, e utilizzate i menu a discesa per selezionare i parametri di accesso. Garantire l'inclusione di un grafico CD16/CD14 e di un grafico che mostra un rilevatore insieme al tempo, per monitorare l'acquisizione. Inserire il tubo e fare clic, acquisire.
Controllare le impostazioni di tensione dello strumento, assicurando che i segnali del rilevatore non siano fuori scala. Osservare le cellule che cadono nel cancello del monocita del grafico CD14/CD16. Impostare la soglia di registrazione su 5.000 eventi per il classico cancello monocito e fare clic sulla registrazione.
Continuare a registrare i dati per i tubi rimanenti. Dopo aver registrato i dati per tutti i tubi, esportare i dati di flusso come file fcs per l'analisi. Per eseguire la gating monocite, aprite i file nel software di analisi, fate doppio clic sul nome del tubo e selezionate i parametri dai menu a discesa per visualizzare le celle su un'area di dispersione in avanti rispetto al grafico dell'altezza di dispersione in avanti.
Create un cancello di esclusione del faretto, facendo clic sull'icona dello strumento cancello poligonale e racchiudendo le celle. Selezionare le celle recingate facendo doppio clic sull'area recintata. Nella nuova casella di visualizzazione, regolate i parametri del menu a discesa per visualizzare le celle su un'area di dispersione in avanti rispetto al tracciato dell'area di dispersione laterale.
Clicca sull'icona del cancello rettangolare e seleziona generosamente la popolazione di monociti, in base alle proprietà di dispersione avanti e laterale, per escludere la maggior parte dei linfociti, delle cellule killer naturali e dei granulociti. Selezionate le celle recintate e rivisualizzate su un plottaggio CD14/CD16, selezionando i parametri utilizzando i menu a discesa. Clicca sul cancello poligonale, per selezionare i monociti in base alla loro caratteristica forma l rovesciata.
Se la popolazione non classica non è distinta dalle cellule alla sua sinistra, allora la contaminazione è probabile e dovrebbe essere studiata. Selezionate le celle gated e visualizzate i monociti su un plottaggio HLA-DR CD/16, utilizzando i menu a discesa per selezionare i parametri. Fare clic sul cancello poligonale per selezionare le cellule positive HLA-DR ed escludere eventuali cellule e neutrofili natural killer rimanenti.
Selezionate le celle gated e visualizzate le celle positive HLA-DR in un plottaggio CD14/HLA-DR utilizzando i menu a discesa per selezionare i parametri. Fare clic sul gate poligonale e disegnare un cancello per escludere le celle B basse HLA-DR high/CD14. Selezionate le celle recintate e utilizzate i menu a discesa per visualizzarle in un plottaggio CD16/CD14.
Dalle opzioni di plottaggio, selezionate il plottaggio zebrato, che consentirà di disegnare i cancelli del sottoinsieme monocito, per determinare le proporzioni dei sottoinsiemi. Ora, fate clic sull'icona della porta rettangolare e selezionate i monociti classici disegnando un cancello rettangolare approssimativo attorno alla bassa popolazione di monociti classici CD14 high/CD16. Sotto la visualizzazione, selezionare, mostrare le mediane, per visualizzare l'intensità di fluorescenza mediana per i monociti classici.
Regolare il cancello in modo che la popolazione abbia una distribuzione uguale dalla mediana a sinistra e a destra, e comprenda tutte le celle a sinistra. Selezionare la popolazione intermedia disegnando una porta rettangolare che racchiude le celle a destra della porta classica. Regolare la parte inferiore del cancello per escludere le celle non classiche, allineando il cancello con il fondo dei cerchi concentrici, che si trovano completamente all'interno della classica porta monocita.
Gate il sottoinsieme non classico, disegnando una casella rettangolare verso il basso dal bordo inferiore del sottoinsieme intermedio, selezionando tutte le celle nella parte inferiore della popolazione. In visualizzazione, selezionare, mostrare le frequenze di gate, per determinare la percentuale di ogni sottoinsieme di monociti. Infine, selezionare le celle da ogni sottoinsieme di monociti.
Modificate i parametri a discesa per creare un istogramma per ogni sottoinsieme di monociti, visualizzando ogni marcatore. Quindi, calcola il grado di espressione, usando la mediana o la media geometrica, come descritto nel protocollo di testo. Qui vengono mostrate popolazioni di monociti recintate con successo.
E le proporzioni sono in linea con quelle della letteratura. Le proporzioni per questo campione sono state calcolate come, 88,1% classico, 4,33% intermedi e 7,49% non classico. Valutando la posizione relativa di altre popolazioni, è chiaro che le cellule T e i neutrofili qui mostrati in blu, seguono ben al di fuori del monocita, forma l rovesciata, su un grafico CD16/CD14.
Tuttavia, sia le cellule killer naturali che le popolazioni di cellule B, mostrate qui in blu, si sovrapponevano alla popolazione di monociti non classica. Le mappe di calore che confermano che i tipi di cellule contaminanti sono state rimosse, sono mostrate qui. Le cellule killer naturali sono state gated fuori dal passo HLA-DR CD16, mentre, le cellule B sono state gated fuori dal passo HLA-DR CD/ 14.
L'espressione dei marcatori M1 e M2 in blu, rispetto ai loro controlli isotipi in rosso, è mostrata qui. CD120b un marcatore M1, mostra un chiaro spostamento sopra il suo controllo isotipo, per tutti i sottoinsiemi di monociti. Questo è anche il caso di CD93 un marcatore M2, con l'espressione più alta nel classico, moderata sugli intermedi e bassa su non classica.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che le celle contaminanti vengano gateed out, in quanto possono altrimenti contribuire all'espressione quantificata. A seguito di questa procedura, possono essere esaminati altri marcatori. Al fine di rispondere a ulteriori domande, come, come cambia l'espressione marcatore monocitare nella malattia.
Non dimenticare che lavorare con sangue umano e formaldeide può essere pericoloso, e quindi precauzioni come i dispositivi di protezione individuale e l'uso di una cappa a rischio biologico, dovrebbero sempre essere prese quando si esegue questa procedura.
