Los autores desean agradecer a Heather Currey por su contribución inicial para el diseño del estudio y el Dr. Swarup Mitra por su revisión crítica del manuscrito. También nos gustaría agradecer al Dr. Michael B. Harris comentarios, refinamientos y asistencia en la producción de la demostración de esta metodología. Las cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis, que está financiado por la oficina de NIH de investigación programas de infraestructura (P40 OD010440). La investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo la concesión número UL1GM118991, TL4GM118992 o RL5GM118990 y por un premio institucional de desarrollo (IDeA) de el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número 5P20GM103395-15. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. UA es un empleador de AA/EO y la institución educativa y prohíbe la discriminación ilegal contra cualquier persona: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. construcción de tamiz de Caenorhabditis y el uso
<ol><li>
Protocolo de construcción
	<ol>
<li>Adquirir 2 tapas de tubos cónicos de 50 mL (figura 1A).</li>
		<li>Quitar el área de centro dentro del borde interno de los párpados (cuando se mira desde la parte inferior, figura 1B) utilizando un mechero Bunsen y una sonda de metal caliente o un soldador o caminó broca. Nota: Usando el calor para cortar la tapa de plástico es preferible una hoja porque hay menos riesgo de lesiones.</li>
		<li>Limpiar y lijar los bordes de corte y superior la superficie con un archivo de curva o un rotatorio (e.g., Dremel) herramienta de pulido. Ver figura 1.</li>
		<li>Cortar el círculo de la malla de monofilamento con el diámetro apropiado (figura 1). Para ello, trazar una tapa sobre una hoja de malla de nylon monofilamento y cortar dentro de la línea dibujada.</li>
		<li>Cortar ranuras/barras diagonales en la superficie superior de los párpados para mejorar la adhesión de los dos párpados cuando se aplica pegamento para plástico (Figura 1E).</li>
		<li>Limpie las tapas con etanol y deje secar.</li>
		<li>Aplique pegamento de cianocrilato en la superficie superior de ambas tapas, manteniendo hasta el borde exterior. Nota: un poco de pegamento va una manera larga.</li>
		<li>Coloque la malla de monofilamento, según la tabla 1, sobre una tapa encolada (Figura 1F). Colocar la segunda tapa invertida encima de la malla; ambas tapas juntos deben tener sus tapas. Presione firmemente junto (figura 1). Asegúrese que la malla esté tensada. Nota: como medida de seguridad, uso de pinzas para colocar la malla en las tapas.</li>
		<li>Una vez que ha secado la capa inicial de adhesivo, aplicar un anillo de pegamento de cianocrilato en el espacio exterior entre las tapas. Ser generosos, ya que esto agrega integridad y evita cualquier pelado aparte o con fuga.</li>
		<li>Etiqueta el filtro con el tamaño de poro de malla de la malla de monofilamento. Nota: Aquí, usamos dos tamaños de poro de malla: 20 μm y 50 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de uso
	<ol>
<li>Humedezca previamente el tamiz.<ol>
<li>Pipetear una solución salina, como M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 L de la poste-limpieza de H2O y 1 mL de MgSO4 (1 M)]17, a través del centro de la criba hasta que se forme gota , se condensa y gotea del centro de la parte inferior del filtro (figura 2A). Opcionalmente, aplicar una toallita libre de pelusas (por ejemplo, Kimwipe) al fondo a la forma o extensión de una gota de humedad sobre la malla.</li>
			<li>Colocar el tamiz sobre un tubo cónico de 50 mL. Etiquetar el tubo como 'Tubo de residuos' (figura 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave una población de C. elegans una placa de agar.<ol>
<li>Lave la placa con el buffer M9 y hacer el medio que contiene el gusano en la parte superior de la malla de monofilamento de 1 mL a la vez (figura 2). Asegúrese de operar en el centro de la malla. Lave todos los gusanos de la placa. Nota: Típicamente, 3 mL de M9 en una placa de 60 mm es suficiente.</li>
			<li>Para minimizar el número de gusanos en el pipeteo, utilice un pipeta Pasteur de vidrio para mover los gusanos fuera del plato y en el centro de la malla (repetir según sea necesario).</li>
			<li>Enjuague el filtro con el buffer M9 de la parte superior. Una vez más, asegúrese de que operar en el centro de la malla y enjuague todos los gusanos en esa zona. Lavar tantas veces como sea necesario para asegurar que todas las bacterias y gusanos más pequeños han pasado a través de la malla.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cosechar los animales emparejados por el tamaño del tamiz.<ol>
<li>Instale un nuevo tubo cónico de 50 mL a la cima del tamiz de los gusanos adultos del paso 1.2.2.3 hacia el interior del tubo nuevo de colección (Figura 2D).</li>
			<li>Retire el primer tubo (tubo de desagüe) y rápidamente se voltea el colador y tubo nuevo para evitar que la gota de migración (Figura 2E). Nota: Si la esterilidad no es necesaria, utilice un trapo sin pelusa (por ejemplo, Kimwipe) fluido mecha desde la parte inferior de la malla antes de los bancos.</li>
			<li>Lavar la malla con la M9 en el nuevo tubo de 50 mL de la nueva superestructura (figura 2F). Otra vez, operar en el centro de la malla y mantener una gotita en la parte inferior de la malla.</li>
			<li>Permitir a los gusanos a depositarse o hace girar suavemente hacia abajo (por ejemplo, < 16 x g) durante aproximadamente 1 minuto (figura 2).</li>
			<li>Aspirar la solución tampón de la pelotilla de gusanos, idealmente a > 0.5 mL, o quitar tanto líquido como sea posible sin perturbar el pellet.</li>
			<li>Pipetear los gusanos utilizando un vidrio pipeta Pasteur sobre una placa de NGM y deje secar. Espacio múltiples gotitas hacia fuera en una nueva placa para que sequen más rápido (figura 2 H).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Limpiar el tamiz.<ol>
<li>Enjuague el colador suavemente y a fondo con etanol y ósmosis inversa de agua. Deje que se seque.</li>
			<li>Almacenar en un recipiente limpio para su uso futuro indefinido.</li>
			<li>Deséchela cuando la malla desarrolla un aspecto de "holgura".</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. validación de Caenorhabditis tamiz método de ordenación
<ol><li>Mantenimiento en general
	<ol>
<li>Para todos los experimentos, cultura gusanos en un estándar medio de crecimiento de nematodos17 (1 L de NGM consta de 2,5 g de peptona, 17 g de agar, 3 g de NaCl, 975 mL de agua doble destilada, 1 mL de colesterol 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl2 1 mL de 1 M MgSO4, 25 mL de 1 M KHPO4y 0,5 mL de estreptomicina 100 mg/mL) a 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Administración del tratamiento experimental
	<ol>
<li>Comparar los grupos de tres tratamiento: selección, fluorodeoxyuridine (FUDR) y tamiz de Caenorhabditis .<ol>
<li>Para el grupo de tratamiento de FUDR, agregue 100 mg/mL FUDR a los medios NGM a una concentración final de 100 μM para prevenir cualquier producción de progenie y transferir los gusanos todos los días a una placa NGM fresca para evitar el agotamiento de la comida.</li>
			<li>Para el grupo de selección, seleccionar y transferir los gusanos manualmente utilizando un asa de platino.</li>
			<li>Para el grupo de tratamiento del tamiz de Caenorhabditis , siga el paso 1.2 y pipetear los gusanos sobre una placa de NGM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis Porcentaje de rendimiento del tamiz
	<ol>
<li>Cuantificar qué tan eficaz es el tamiz en la clasificación de C. elegans, crecer edad síncrono N2 animales a día 1 de la edad adulta a 25 ° C (es decir, 48 h después de la puesta de huevos) y luego transferirlos por escoger a platos frescos de NGM (N total = 50 o N = 100 animales por tre atment grupo).</li>
		<li>Después de 24 horas de recuperación, transferencia de la población a nuevas placas NGM con el tamiz de Caenorhabditis siguiendo el anterior protocolo (véase el paso 1.2) y contar el número de animales transferidos con éxito.</li>
		<li>Calcular el porcentaje de rendimiento como el cociente entre el número de animales transferidos en comparación con el número inicial al principio de la transferencia multiplicado por 100 (%).</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan ensayos Nota: Puntuación healthspan parámetros de la clase de movilidad, la velocidad de la bomba faríngea y el anterior y la respuesta posterior de tacto suave en los días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta por edad-que sincronizados N2 animales mantenidos a 25 ° C.<ol>
<li>Seguimiento de la movilidad<ol>
<li>Asignar puntuaciones de movilidad basados en un sistema basado en clases (clases A, B y C) siguiendo los métodos de Herndon et al. 18. comparar los efectos de los tres grupos experimentales utilizando un modelo de la ordinal logístico estadísticas en software de análisis estadístico. Nota: Personas de clase A moverse espontáneamente en un patrón normal, sinusoidal. Individuos de la clase B se mueven en movimientos marcadamente no-sinusoidal y requieran insistencia para animar movimiento. Individuos de la clase C movieran su cabeza o cola en respuesta a la insistencia pero son incapaces de moverse en el agar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Velocidad de la bomba faríngea<ol>
<li>Cuenta el movimiento de la amoladora del terminal bulbo faríngeo del animal visualmente bajo un estereomicroscopio en 600 X final aumento durante 1 minuto.</li>
			<li>Realizar un análisis estadístico con un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y post-test de Bonferroni con α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Respuesta táctil<ol>
<li>Registrar una respuesta de toque suave y comparar entre los grupos de tres tratamiento. Realizar el análisis basados en los métodos descritos por Calixto et al. 19.</li>
			<li>Registro de la parte anterior y posterior toquen respuesta por suavemente acariciando una pestaña selección perpendicular a través de la cola o la cabeza (5 x, alterna cabeza y cola) de los animales.</li>
			<li>Anotar cualquier movimiento en la dirección opuesta del trazo como 1 punto en una escala de 0 a 5 para la parte anterior y la posterior respuesta.</li>
			<li>Llevar a cabo análisis estadístico con un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y post-test de Bonferroni con α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de la fecundidad
	<ol>
<li>Para determinar el uso de impacto del tamiz de Caenorhabditis en reproducción, crecer edad síncrono N2 animales al día 2 de la edad adulta a 25 ° C.</li>
		<li>60 h después de ponga huevo, transferencia de animales para nuevas placas NGM con una selección platino o el tamiz de Caenorhabditis y les dan 4 h para recuperar (seque las placas tamizadas para 20-30 min).</li>
		<li>Después de la recuperación, placa individual de escoger los animales a través de una pestaña a planchas NGM, les dan 24 horas para poner huevos y retirar los animales. Permitir que la progenie en cada plato para desarrollar en condiciones normales a 25 ° C por 24 h otro. Nota: Una selección de pestañas es una pestaña humana asegurado hasta el final de una pipeta Pasteur con esmalte de uñas y esterilizado con etanol.</li>
		<li>Contar el número de individuos de generación F1 viables. Realizar un análisis estadístico utilizando una prueba T con α = 0.05. Nota: Descendencia Viable se considera huevos que eclosionan y comienzan su desarrollo a través de los ciclos regulares de larvas con éxito.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayos de respuesta de estrés reportero fluorescente
	<ol>
<li>Realizar tres ensayos reportero fluorescente utilizado para detectar posibles marcadores de estrés: un desplazamiento de la DAF-16::GFP en los núcleos de las células en una cepa [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; expresión de hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; y una expresión de la sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>Para cada ensayo, cultura animales sincrónica a la edad de los grupos de tratamiento de tres a 20 ° C y examinar en el día 3 de la edad adulta: utilizar un control negativo (sobre una base diaria, transferencia de un grupo de animales manualmente con un pico de platino), un control positivo (sobre una base diaria transferencia de un grupo de animales manualmente con un pick de platino además de un estresor establecido) y el tamiz de Caenorhabditis (pasar los animales a través del tamiz y que puedan recuperar durante 30 min en el NGM justo antes de la proyección de imagen).</li>
		<li>En el ensayo de DAF 16::GFP, calor choque los animales control positivo a 37 ° C por 30 min antes de la proyección de imagen20. Para el análisis de hsp-16.2, calor choque los animales de control positivo de 90 min, 20 h antes de la proyección de imagen21. Para el análisis de la sod-3, tratar los animales de control positivo con paraquat 100 mM durante 4 horas antes de la proyección de imagen22.</li>
		<li>Los gusanos inmediatamente con una selección de pestañas de la cosecha y montar a un cubreobjetos con 1 μL de una solución de surfactante 407 36% poloxamer para inmovilizar los gusanos.</li>
		<li>Los gusanos montados con otro cubreobjetos del emparedado. Monte los dos cubreobjetos y un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar de imagen los gusanos con una ampliación de 8 X en un microscopio fluorescente invertido (para una ampliación total de 80 X) y una exposición constante con un filtro FITC.</li>
		<li>Para detectar diferencias entre los tres grupos en el ensayo 16::GFP DAF, clasificar los animales según la ubicación de la reportera 16::GFP DAF (nuclear si el reportero transloca al núcleo, citosol si el reportero encuentra en citosol y si es intermedio el reportero situado en núcleo y citosol).</li>
		<li>Comparar los resultados usando un modelo estadístico de logística ordinal en el software de análisis estadístico. Para hsp-16.2 y los análisis de expresión de la sod-3, un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y las pruebas post hoc de Tukey con α = 0.05 para comparar la fluorescencia total de la región de la cabeza.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+conferring+life+extension+and+resistance+to+UV+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).</li><li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress.">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li><li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar. Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

En este documento, presentamos el diseño y el uso del tamiz de Caenorhabditis accesible, eficaz como herramienta para ordenar y mantener la C. elegans. Esta herramienta tiene varias ventajas para escoger manualmente cada animal, el lavado de las poblaciones, tratamientos químicos (p. ej., FUDR) y más costosos métodos de segregación de animales. En primer lugar, el Caenorhabditis tamiz de forma eficiente y rápida (menos de 20 min) clases descendientes de grandes poblaciones mixtas...

El gusano nematodo Caenorhabditis elegans, es un organismo modelo principal. Además de la naturaleza sencilla y controlada de su cultivo en el laboratorio, es de su genoma completo secuenciado1 y el destino del desarrollo de cada célula se conoce2. Debido a estas características, C. elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado para los estudios genéticos. Sin embargo, junto con estas características beneficiosas vienen algunos desafíos para los investigadores. Debido a su tiempo de generación rápido, las poblaciones de C. elegans pueden quedarse rápidamente sin alimentos o mezcladas poblaciones con múltiples generaciones y etapas de desarrollo se presentan a la vez. Por lo tanto, experimentos llevados a cabo en medios del sólido crecimiento de nematodos (NGM) requieren investigadores moverse físicamente animales a platos frescos antes de agota la fuente bacteriana de alimentos y desarrollan de nuevas larvas. Esto puede ser tedioso como una transferencia frecuente de los animales es necesaria para evitar que las poblaciones experimentales de ser mezclado con generaciones de crías. Aún así, algunos experimentos requieren ambos números grandes de animales y puntos de tiempo prolongado (por ejemplo, la extracción de DNA o RNA en la edad adulta). Esto agrava los retos de mantener una población sincronizada con precisión y transferir grandes cantidades de animales.
Los métodos actuales de transferencia de C. elegans cultivadas el NGM se cosecha o lavar los animales placa; tratando químicamente los animales (por ejemplo, con la replicación de ADN inhibidor fluorodeoxyuridine o FUDR); o mediante citometría de flujo para clasificar los animales en placas de varios pocillos. Selección implica el uso de una herramienta de mano, hecha con un alambre fino de platino o una pestaña, a transferir manualmente individuales o múltiples animales3,4. Este método es exacto, pero requiere habilidad y tiempo y es una limitación para estudios con gran número de animales. Cosecha de mayo también ser físicamente perjudiciales y estresante para los animales potencialmente someter a individuos a cantidades inconsistentes y antinaturales del disturbio y de fuerza. Lavado consiste en enjuagar una placa de cultivo con una solución tampón y transferir la solución con los animales con pipeta Pasteur de vidrio a una placa de cultivo nuevo. Este método es rápido y eficiente pero no es exacto como múltiples generaciones y etapas de desarrollo de los animales se transfieren a granel. Tratamientos químicos, tales como FUDR, pueden ser disuelto en los medios de cultivo para evitar la producción de descendencia a través del bloqueo de cualquier réplica de la DNA y por lo tanto, el desarrollo de la producción y huevos de gametos. Si bien efectivo, este método debe ser aplicado después de la maduración del desarrollo en cuanto a no alterar los procesos normales de desarrollo, y esto significa que aún es un requisito para la transferencia de los animales antes de su administración3. Este método también influencias múltiples celular vías de señalización, dando por resultado efectos notables sobre los animales a medida que envejecen (p. ej., una extensión de vida útil o una alterada proteostasis) dependiendo de la cepa de C. elegans utilizadas5, 6,7,8,9,10. Métodos de citometría de flujo automáticamente clasificar y transferir individual C. elegans de una placa de un bien a otro11. Si bien este método es muy eficaz y eficiente, equipos de citometría de flujo es prohibitivamente costoso e inaccesible para muchos investigadores. Una alternativa a la transferencia de animales es usar modelos mutantes termosensible, como fer-15 fem-1, que se convierten en estériles con ajuste de temperatura12. Mientras que el uso de animales mutantes es útil en algunas situaciones, estas cepas específicas crecen más lentamente que los animales de tipo silvestre y dependen de un genoma alterado, que sirve como representantes pobres gusanos envejecimiento o sano. Además, la dependencia de un cambio de temperatura para inducir esterilidad también resulta en la ausencia de un entorno estático, y los cambios de temperatura han demostrado fácilmente influir gene expresiones13,14, 15. grupos de investigación anteriormente han publicado técnicas que describe el uso de una malla para filtrar C. elegans por tamaño16. Sin embargo, hemos podido encontrar trabajo previo para cualquier cambio en los resultados generales de salud que pueden estar asociados con el uso de estos filtros.
Por lo tanto, es una necesidad dentro de la comunidad de investigación de C. elegans para un método asequible, eficiente, rápido y preciso para la transferencia de grandes cantidades de animales entre placas. Hemos desarrollado una pieza accesible, mejora de equipo (nombrado el tamiz de Caenorhabditis ) y un protocolo asociado para su fabricación y funcionamiento que satisfaga las necesidades de la comunidad de investigación de C. elegans . Aquí, compartimos el diseño de la criba de Caenorhabditis y métodos para su uso, y nos demuestran que su uso no afecta la salud común o cualquier marcador de estrés en comparación con la cosecha manual estándar y un tratamiento con el uso común, restricción de fertilidad química FUDR.

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo bien establecido usado en una amplia gama de investigación básica y biomédica. Dentro de la comunidad de nematodos de la investigación, hay una necesidad de una forma asequible y eficaz mantener poblaciones grandes, edad comparable de C. elegans. Aquí, presentamos una metodología para la clasificación mecánica y limpieza C. elegans. Nuestro objetivo es proporcionar un proceso rentable, eficiente, rápido y simple para obtener animales de tamaños uniformes y estadios para su uso en experimentos. Esta herramienta, el tamiz de Caenorhabditis , utiliza un sistema de tapa a la medida que los hilos de rosca en tubos de laboratorio cónico común y tipo C. elegans basado en tamaño de cuerpo. También demostramos que el tamiz de Caenorhabditis efectivamente transfiere animales de placa de un cultivo a otro lo que permite una rápida clasificación, sincronización y limpieza sin afectar a los marcadores de salud, incluyendo la movilidad e inducible por estrés Reporteros de gene. Esta herramienta accesible e innovador es una opción rápida, eficiente y no estresante para el mantenimiento de las poblaciones de C. elegans .

El tamiz de Caenorhabditis consta de 2 tapones, asegurando una superficie de malla de monofilamento de nylon tejido más pequeño que el diámetro del cuerpo de la edad del desarrollo deseado, usado para extraer energizadas poblaciones de organismos usando una técnica simple lavado. Fijaciones para tubos cónicos y la malla se utiliza para ordenar mecánicamente animales por el diámetro del cuerpo, dejando los animales deseados en el tubo lista para más mantenimiento y experim...

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

El protocolo actual incluye una metodología para la clasificación y limpieza de las poblaciones de edad comparable de elegans de Caenorhabditis. Utiliza un simple, barato y eficaz herramienta a la medida para obtener una población experimental de nematodos para la investigación.

Caenorhabditis Tamiz: Un instrumento de baja tecnología y metodología para la clasificación de los organismos multicelulares pequeños

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K vistas.  University of Alaska Fairbanks. El protocolo actual incluye una metodología para la clasificación y limpieza de las poblaciones de edad comparable de elegans de Caenorhabditis. Utiliza un simple, barato y eficaz herramienta a la medida para obtener una población experimental de nematodos para la investigación.

Video: Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultivo Y Ensayo De Las Poblaciones De Caenorhabditis elegans De Etapa Mixta A Gran Escala

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Investigación

Genética

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Inmunología e Infección

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Neurociencias

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Biología

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

Clasificación de<em&gt; Streptomyces</em&gt; Pellets de celda que utilizan un objeto complejo paramétrico Analyzer y Clasificador

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Microdisección láser para aplicaciones de un solo tejido independientes de la especie

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Disección manual de los intestinos de Caenorhabditis elegans

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Disociación unicelular de Caenorhabditis elegans: un método para aislar células vivas

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...

Caenorhabditis Tamiz: Un instrumento de baja tecnología y metodología para la clasificación de los organismos multicelulares pequeños

Resumen

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Capítulos en este video

Cultivo Y Ensayo De Las Poblaciones De Caenorhabditis elegans De Etapa Mixta A Gran Escala

La separación automatizada de

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo

Básico

Clasificación de

Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing

Microdisección láser para aplicaciones de un solo tejido independientes de la especie

Disección manual de los intestinos de Caenorhabditis elegans

Disociación unicelular de Caenorhabditis elegans: un método para aislar células vivas