El objetivo principal de este experimento es describir un procedimiento de transferencia de embriones laparoscópico en conejo como modelo. La principal ventaja de esta técnica es que este trabaja para transferir embriones utilizando una técnica fácil y mínimamente invasiva. Además, el eficaz protocolo de criopreservación de embriones aquí descrito también funciona para el almacenamiento a largo plazo de los embriones de conejo, proporcionando capacidades logísticas flexibles en el tiempo y la capacidad de transportar la muestra.
Como sabemos, las tecnologías de reproducción asistida están en evaluación continua para mejorar los resultados y reducir los riesgos asociados. Por lo tanto, utilizando ambas técnicas, el conejo se puede utilizar como un modelo animal ideal de reproducción humana para responder a preguntas clave en este campo, tales como los efectos de la manipulación in vitro del embrión en la descendencia. La demostración visual de estos asuntos es crítica ya que los pasos de transferencia de embriones son difíciles de aprender, porque debe hacerse con gran precisión para asegurar el éxito de la técnica.
Para la vitrificación embrionaria, sumerja los embriones en solución de equilibrio durante dos minutos, seguido de una incubación de un minuto en solución de vitrificación. Al final de la incubación, cargue los embriones en una mini-paja de plástico de 125 microlitros, y combine el extremo cerrado de la mini-paja con un microdispensor de un mililitro apropiado. Aspirar el medio base hasta un tercio de la longitud de la paja, seguido de una pequeña burbuja de aire.
A continuación, utilice un estereomicroscopio para aspirar los embriones en 40 microlitros de solución de vitrificación, seguido de otra pequeña burbuja de aire y suficiente medio base para mover la primera fracción líquida hasta el algodón de la mini-paja. A continuación, cierre el extremo abierto de la mini-paja con un tapón de paja, sumerja la mini-paja directamente en nitrógeno líquido para lograr la vitrificación, y almacene la mini-paja en una dewar de nitrógeno líquido. Para descongelar los embriones para una transferencia, coloque la mini-paja horizontalmente a 10 centímetros del vapor de nitrógeno líquido durante 20 a 30 segundos.
Cuando el proceso de cristalización comience dentro de la mini-paja, sumerja la mini-paja en el baño de agua de 25 grados celsius durante 10 a 15 segundos. Retire inmediatamente los tapones de mini-paja y algodón y utilice un microdispensor acoplado para expulsar el contenido de mini-paja en una placa que contenga un medio base de 25 grados centígrados complementado con una solución de sacarosa molar de 0,33, en la que los embriones deben permanecer durante cinco minutos. A continuación, transfiera los embriones a un plato de medio base fresco para otra incubación de cinco minutos.
Tantos días antes como la edad de los embriones a transferir, observar la turgencia y el color de las vulvas de los conejos hembra de 4,5 meses de edad sexualmente maduros disponibles, e inducir la ovulación en los animales receptivos con una sola inyección intramuscular de un microgramo de buserelina acetato independientemente del peso corporal. El día de la transferencia, enjuague los embriones frescos o descongelados en un medio base de 37 grados centígrados bajo un estereomicroscopio, y conecte un catéter epidural de calibre 17 configurado adecuadamente a una jeringa de un mililitro. Aspirar un centímetro de media base en el catéter, seguido de una pequeña burbuja de aire.
A continuación, aspirar de cinco a siete embriones y 10 microlitros de medio base, seguido de otra pequeña burbuja de aire, y un último un centímetro de media base. Una vez cargados los embriones, coloque el conejo receptor anestesiado en una jaula en una etapa de calentamiento, y aplique ung ón en los ojos del animal. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, afeite el pelaje del abdomen ventral, limpie el área quirúrgica con jabón de gluconato de clorhexidina y retire el cabello restante.
Cubra el área con una cortina estéril con un orificio para el área quirúrgica, e inserte un trocar endoscópico de cinco centímetros en la cavidad abdominal, dos centímetros caudales para el proceso de la phoide, y utilice un insuflador mecánico regulador de presión para inflar la cavidad peritoneal. Inserte la cámara del endoscopio a través del trocar endoscópico e inserte la aguja epidural del calibre 17 en la región inguinal, de dos a tres centímetros del infundibulum. Inserte el catéter cargado a través de la aguja epidural en el abdomen e inserte de uno a dos centímetros del catéter epidural a través del infundibulum en la ampolla.
Presione suavemente el émbolo del catéter para liberar los embriones en el oviducto. Ambas burbujas de aire deben salir del catéter. Retire el catéter justo después de que los embriones hayan sido liberados, y aspire y libere el medio restante para confirmar la ausencia de los embriones.
Después de confirmar una transferencia exitosa de los embriones, retire la aguja epidural y la cámara del endoscopio, y libere el dióxido de carbono abdominal a través del trocar endoscópico. Limpie la incisión del trocar con solución de clorhexidina y cierre la herida con un aluminio micronizado y un apósito de plástico. Luego trate al animal con los antibióticos y analgésicos apropiados, y monitoree al animal hasta su recuperación completa.
La transferencia laparoscópica mínimamente invasiva de embriones coloca al conejo entre los mejores modelos animales para estudios reproductivos, con un alto porcentaje de embriones frescos transferidos que resultan en un cachorro. En particular, se alcanzan valores más altos cuando la transferencia de embriones frescos se realiza con embriones en la etapa morulae temprana o compacta. Se observan resultados similares después de la transferencia temprana y compacta de la morula de conejo vitrificado, particularmente con morulas compactas, lo que confirma la eficacia y fiabilidad de esta técnica para la transferencia de embriones frescos en vitrificados en conejos.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como las tecnologías de reproducción de asistencia condicional con el fin de responder a preguntas adicionales como cómo la adición de densidades puede incurrir en un efecto analgésico más adelante en la vida. Después del desarrollo reciente, esta técnica allana el camino para que los científicos en el campo de la reproducción exploren este efecto en humanos basado en la estrecha distancia filogenética entre el conejo y los seres humanos. Por lo tanto, esta técnica puede proporcionar resultados fácilmente transferibles a la medicina clínica humana, así como en otras especies de mamíferos.
No olvide que nuestro método ofrece algunas ventajas higiénicas y económicas que se ajustan al concepto de tres R de bienestar animal, reemplazo, reducción y refinamiento, con la intención de mejorar el tratamiento humano de los animales experimentales.
