O principal objetivo deste experimento é descrever um procedimento de transferência de embrião laparoscópico em coelho como modelo. A principal vantagem dessa técnica é que esta trabalha para transferir embriões usando uma técnica fácil e minimamente invasiva. Além disso, o protocolo eficaz de criopreservação de embriões aqui descrito também funciona para armazenar a longo prazo os embriões de coelho, fornecendo capacidades logísticas flexíveis de tempo e a capacidade de transportar a amostra.
Como sabemos, as tecnologias de reprodução assistida estão em avaliação contínua para melhorar os resultados e reduzir os riscos associados. Portanto, utilizando ambas as técnicas, o coelho pode ser usado como um modelo animal ideal de reprodução humana para responder a questões-chave neste campo, como os efeitos da manipulação in vitro de embriões na prole. A demonstração visual dessas questões é fundamental, pois as etapas de transferência de embriões são difíceis de aprender, pois devem ser feitas com grande precisão para garantir o sucesso da técnica.
Para vitrificação embrionária, mergulhe os embriões em solução de equilíbrio por dois minutos, seguido de uma incubação de um minuto na solução de vitrificação. No final da incubação, carregue os embriões em um mini-canudo plástico de 125 microliter, e junte a extremidade fechada da mini-palha com um microdispensor de mililitro apropriado. Média de base aspirada até um terço do comprimento da palha, seguida por uma pequena bolha de ar.
Em seguida, use um estereómicocópio para aspirar os embriões em 40 microlitros de solução de vitrificação, seguido por outra pequena bolha de ar e meio base suficiente para mover a primeira fração líquida até o algodão da mini-palha. Em seguida, feche a extremidade aberta da mini-palha com um plugue de palha, mergulhe a mini-palha diretamente em nitrogênio líquido para alcançar a vitrificação, e armazene a mini-palha em uma de guerra de nitrogênio líquido. Para descongelar os embriões para uma transferência, coloque a mini-palha horizontalmente 10 centímetros do vapor de nitrogênio líquido por 20 a 30 segundos.
Quando o processo de cristalização começar dentro da mini-palha, mergulhe a mini-palha no banho de água de 25 graus celsius por 10 a 15 segundos. Remova imediatamente os plugues de mini-palha e algodão e use um microdispensador acoplado para expulsar o conteúdo mini-palha em uma placa contendo 25 graus celsius médio de base suplementado com solução de sacarose molar 0,33, na qual os embriões devem permanecer durante cinco minutos. Em seguida, transfira os embriões para uma placa de meio base fresca para mais cinco minutos de incubação.
Tantos dias antes da idade dos embriões a serem transferidos, observe a turgididade e a cor das vulvas dos coelhos fêmeas de 4,5 meses de idade disponíveis, e induza a ovulação nos animais receptivos com uma única injeção intramuscular de um micrograma de acetato de buserelina, independentemente do peso corporal. No dia da transferência, enxágue os embriões frescos ou descongelados em meio base de 37 graus celsius sob um estereóscópio, e conecte um cateter peridural de calibre 17 configurado adequadamente a uma seringa de um mililitro. Aspire um centímetro de meio base no cateter, seguido por uma pequena bolha de ar.
Em seguida, aspirar cinco a sete embriões e 10 microliters de meio base, seguido por outra pequena bolha de ar, e um último centímetro de meio base. Uma vez que os embriões tenham sido carregados, coloque o coelho receptor anestesiado em uma gaiola em um estágio de aquecimento, e aplique pomada aos olhos do animal. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, raspe a pele do abdômen ventral, limpe a área cirúrgica com sabão de gluconato de clorexidina e remova qualquer cabelo restante.
Cubra a área com uma cortina estéril com um orifício para a área cirúrgica, e insira um trocatometro endoscópico de cinco centímetros na cavidade abdominal, dois centímetros caudais ao processo zifóide, e use um insufrácia mecânica reguladora de pressão para inflar a cavidade peritoneal. Insira a câmera do endoscópio através do trocarte endoscópico e insira a agulha peridural de 17 bitolas na região inguinal, de dois a três centímetros do infundibulum. Insira o cateter carregado através da agulha peridural no abdômen, e insira de um a dois centímetros do cateter peridural através do infundibúlum na ampola.
Deprimir suavemente o êmbolo do cateter para liberar os embriões no oviduto. Ambas as bolhas de ar devem sair do cateter. Remova o cateter logo após a liberação dos embriões, aspire e solte o meio restante para confirmar a ausência dos embriões.
Após confirmar uma transferência bem sucedida dos embriões, remova a agulha peridural e a câmera endoscópio, e libere o dióxido de carbono abdominal através do trocarte endoscópico. Limpe a incisão do trocarte com solução de clorexidina e feche a ferida com um alumínio micronárido e um curativo plástico. Em seguida, trate o animal com os antibióticos e analgésicos apropriados, e monitore o animal até a recuperação completa.
A transferência minimamente invasiva de embriões laparoscópicos coloca o coelho entre os melhores modelos animais para estudos reprodutivos, com uma alta porcentagem de embriões frescos transferidos resultando em um filhote. Notavelmente, valores mais elevados são alcançados quando a transferência de embriões frescos é realizada com embriões no estágio morulae precoce ou compacto. Resultados semelhantes são observados após a transferência precoce e compactada de morula de coelho, particularmente com morulae compacta, confirmando a eficácia e a confiabilidade desta técnica para a transferência de embriões in vitrificados frescos em coelhos.
Após esse procedimento, outros métodos como tecnologias reprodutivas assistivas condicionais podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como como a adição de densidades pode incorrer em um efeito analgésico mais tarde na vida. Após o desenvolvimento recente, essa técnica abre caminho para os cientistas do campo da reprodução explorarem esse efeito em humanos com base na distância filogenética próxima entre coelho e humanos. Assim, essa técnica pode fornecer resultados facilmente transferíveis para a medicina clínica humana, bem como em outras espécies de mamíferos.
Não se esqueça que nosso método oferece algumas vantagens higiênicas e econômicas em conformidade com o conceito de três R's de bem-estar animal, Substituição, Redução e Refinamento, com a intenção de melhorar o tratamento humano de animais experimentais.
