この実験の主な目的は、ウサギにおける腹腔鏡下胚移植手順をモデルとして記述することです。この技術の主な利点は、これは簡単で低侵襲の技術を使用して胚を移すために働くということです。さらに、ここで説明する有効な胚凍結保存プロトコルは、ウサギの胚を長期保存するためにも働き、時間の柔軟性のある物流能力およびサンプルを輸送する能力を提供する。
私たちが知っているように、生殖補助技術は、結果を改善し、関連するリスクを軽減するために継続的な評価を行っています。したがって、両方の技術を用いて、ウサギは、ヒト生殖の理想的な動物モデルとして、子孫に対するインビトロ胚操作の効果など、この分野の重要な質問に答えるために使用することができる。これらの問題の視覚的なデモンストレーションは、胚の移動ステップが学ぶのが難しいため、技術の成功を確実にするために非常に正確に行わなければならないので、重要です。
胚性ガラス化の場合、胚を平衡溶液に2分間浸漬し、続いてガラス化溶液に1分間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、胚を125マイクロリットルのプラスチックミニストローにロードし、ミニストローの閉じた端を適切な1ミリリットルのマイクロディスペンサーと組み合わせる。吸気塩基剤は、ストロー長の3分の1まで培地を吸引し、続いて小さな気泡を続ける。
次に、40マイクロリットルのガラス化溶液で胚を吸引するために実体顕微鏡を使用し、続いて別の小さな気泡とミニストローの綿まで最初の液体分画を移動させるのに十分なベース媒体を使用する。次に、ストロープラグでミニストローの開いた端を閉じ、ミニストローを液体窒素に直接突っ込んでガラス化を達成し、ミニストローを液体窒素デュワーに保管します。移動のために胚を解凍するには、液体窒素蒸気から10センチメートルのミニストローを20〜30秒間水平に置きます。
ミニストローの中で結晶化プロセスが始まったら、ミニストローを25°Cの水浴に10〜15秒間浸します。すぐにミニストローと綿のプラグを取り外し、結合したマイクロディスペンサーを使用して、0.33モルスクロース溶液を添加した25度の摂氏ベース培地を含むプレートにミニストローの内容物を排出し、胚は5分間保持する必要があります。その後、胚を新鮮なベース培地のプレートに移し、さらに5分間インキュベーションを行います。
移される胚の年齢と同じくらい数日前に、利用可能な性的に成熟した4.5ヶ月の雌ウサギの外陰部の濁度と色を観察し、体重に関係なく1マイクログラムのブセレリン酢酸の単一の筋肉内注射で受容動物に排卵を誘発する。転写日に、新鮮なまたは解凍した胚を37°の塩基性培地で実体顕微鏡ですすい、適切に構成された17ゲージ硬膜外カテーテルを1ミリリットルのシリンジに取り付ける。1センチのベース培地をカテーテルに吸引し、続いて小さな気泡を吸引する。
次いで、5~7個の胚と10マイクロリットルのベース培地を吸引し、続いて別の小さな気泡を、最後の1センチメートルのベース培地を吸引する。胚がロードされたら、麻酔を受けたウサギを温暖化段階のケージに入れ、動物の目に軟膏を塗布する。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、腹側腹部から毛皮を剃り、クロルヘキシジングルコン酸石鹸で外科領域をきれいにし、残りの毛髪を取り除きます。
外科領域のための穴で無菌のカーテンで領域をカバーし、腹腔に5センチメートル、zyphoidプロセスに2センチメートル尾を張って1つの内視鏡トロカールを挿入し、腹膜腔を膨らませるために機械的インスフレーターを調節する圧力を使用する。内視鏡カメラを内視鏡トロカールに挿入し、17ゲージ硬膜外針をインギナル領域(インファンディブラムから2〜3センチメートル)に挿入します。装填されたカテーテルを硬膜外の針を通して腹部に挿入し、円形の内隔を通して硬膜外カテーテルの1〜2センチメートルを挿入する。
カテーテルプランジャーを軽く押し落とし、胚を卵管に放出する。両方の気泡はカテーテルから出なければなりません。胚が放出された直後にカテーテルを取り出し、残りの培地を吸引して放出して胚の不在を確認する。
胚の転写が成功したことを確認した後、硬膜外針と内視鏡カメラを取り外し、内視鏡トロカールを通して腹部二酸化炭素を放出する。クロルヘキシジン溶液でトロカール切開部を洗浄し、ミクロニシズアルミニウムとプラスチックドレッシングで創傷を閉じます。次に、適切な抗生物質と鎮痛薬で動物を治療し、完全に回復するまで動物を監視します。
低侵襲腹腔鏡下胚移植は、生殖研究のための最良の動物モデルの中にウサギを配置し、繁殖した新鮮な胚の割合が高く、子犬をもたらす。特に、早期またはコンパクトなmorulaeステージのいずれかで胚で新鮮な胚移植が行われると、より高い値が達成される。同様の結果は、早期および圧縮されたガラス化されたウサギのモルラ転移後、特にコンパクトなmorulaeで観察され、ウサギの新鮮なガラス化胚を移すこの技術の有効性および信頼性を確認する。
この手順に従って、条件付き生殖生殖技術のような他の方法は、密度の添加が人生の後半に鎮痛効果を引き起こす可能性があるような追加の質問に答えるために行うことができます。最近の開発の後、この技術は、ウサギと人間の間の密接な系統的距離に基づいて、生殖分野の科学者がこの効果を探求する道を開きます。したがって、この技術は、他の哺乳動物種において同様にヒト臨床医学に容易に移すことができる結果を提供することができる。
実験動物の人間の治療を改善するという目標を意図して、私たちの方法は、動物の福祉、交換、削減、改良の3つのRの概念に準拠するいくつかの衛生的および経済的利点を提供することを忘れないでください。
