Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicología germinal humana, como cómo se crean o reparan los daños en el genoma de las células germinales primordiales humanas. La principal ventaja de esta técnica es que las células germinales primordiales humanas se pueden generar en dos semanas a partir de las células iPS de pluripotencia cebada que albergan antecedentes genéticos de predisposición de la enfermedad. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la prevención del deterioro genómico en las células germinales humanas, porque nuestro modelo de cultivo celular puede ayudarnos a reducir la toxicidad germinal de un fármaco terapéutico.
Para comenzar con la generación de células germinales primarias humanas, o PGCLC humanos, prepare placas recubiertas de proteínas de matriz extracelular y suspensión celular de iPSC humanos, como se describe en el protocolo de texto. Preparar una suspensión de una sola célula de iPSC humanos de pluripotencia cebada en el medio mTeSR1 que contiene el inhibidor de la quinasa Y-27632 Rho. Ajuste cuidadosamente la densidad celular a 100.000 células por mililitro.
Inocular dos mililitros de suspensión celular de iPSC humanos cebados en cada poc de la proteína de matriz extracelular recubierta de seis pomos, asegurándose de que las células se distribuyen uniformemente agitando las placas vertical y horizontalmente. Incubar las placas en una incubadora de CO2 de tres gases a 37 grados centígrados. Es muy importante inocular exactamente 200.000 células en cada pozo de una placa de seis pozos.
El conteo preciso de las células es crítico. Después de completar la conversión transitoria a la pluripotencia ingenua, las celdas deben verse sobre-confluentes, lo cual es normal. La sincronización exacta del cambio medio es importante para lograr altos PGCLC humanos y reproducibilidad experimental.
La densidad del cultivo de hiPSC 4i es alta en estas condiciones, y se espera que la célula se confluya en las 48 a 72 horas después de la inoculación. 24 horas después de la inoculación, cambie el medio con dos mililitros por pozo de mTeSR1 medio sin Y27632. Comience la conversión de iPSC humanos de estado de pluripotencia cebado a células madre pluripotentes ingenuas de 4i, calentando 50 mililitros de 4i de medio completo en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 15 minutos.
A las 48 y 72 horas después de la inoculación, retire las placas de la incubadora y cambie el medio con 2 mililitros por pocillo de 4i de medio completo. Centrifugar la placa de micropocillos recubierto de detergente a 1.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Inspeccione los pozos con microscopio invertido para garantizar la ausencia de burbujas de aire.
Enjuague los pozos como se describe en el protocolo de texto y repita la centrifugación. Añadir 4i medio completo a los pozos enjuagados. Centrifugar la placa a 1.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente e inspeccione de nuevo los pozos.
Para inocular iPSC humanos 4i en la placa de micropocillos, prepare la suspensión de células iPSC humanas como se describe en el protocolo. Filtre esta suspensión celular a través de un colador celular de 40 micrómetros de tamaño de poro para eliminar agregados celulares. Lavar el colador con un mililitro de 4i precale calentado medio tres veces para recoger todas las células del colador, y contar las células con un contador de cultivo.
Luego, diluir esta suspensión de una sola célula de iPSC humanos ingenuos de 4i a 27 a 32,4 millones de células en 9 mililitros precalendigado 4i medio completo que contiene Y27632. Retire la placa de micropocillos previamente preparada que contenga 1 mililitro de 4i de medio completo por pozo de una incubadora de tres gases. Inocular 1 mililitro de suspensión iPSC humana ingenua de 4i en cada poc, para lograr una concentración de 3,0 a 3,6 millones de células por pozo.
Pipeta suavemente para distribuir uniformemente las células. Centrifugar la placa a 100 g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Colocar la placa en una incubadora de CO2 de gas trigás, asegurándose de no molestar a las células peletizadas en micropocillos, e incubar durante 24 a 30 horas, porque una incubación durante la noche es insuficiente para la formación de cuerpos embrionarios apretados o EBs.
Precalzo 5 mililitros de medio basal PGCLC humano y 20 mililitros de PGCLC humanos completo medio durante al menos cinco minutos en un baño de agua de 37 grados Celsius Coloque cuidadosamente un colador celular de 40 micrómetros de tamaño poro al revés sobre un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros. Para separar los EB de los micropocillos, pipetee suavemente cada pozo de la placa. Para eliminar las células no incorporadas en los EB, filtre el contenido de todos los pozos a través del colador celular.
Lave suavemente los EBs retenidos en la membrana del colador celular con 1 mililitro de medio basal PGCLC humano precalegado, y repita el lavado cinco veces. Coloque un tubo cónico fresco de 50 mililitros en el colador celular, de modo que el colador celular ahora se coloque del lado derecho hacia arriba en el nuevo tubo. Invierta rápidamente el colador celular con el nuevo tubo, que colocará los EBs por debajo de la membrana del colador celular.
Añadir 18 mililitros de PGCLC humano precale calentado medio completo a la membrana del colador celular para recoger EBs en el tubo cónico. A continuación, placa de 3 mililitros por pozo de la suspensión de EBs en pozos de una placa de seis pozos de fijación baja. Coloque la placa sobre un balancín de movimiento de sierra en una incubadora de tres gases, y ajuste cuidadosamente la velocidad de balanceo a aproximadamente 20 vueltas por minuto.
En el día siete al 13 del experimento, recién preparar 20 mililitros de PGCLC humano medio completo cada día. Retire la placa del balancín, lo que hará que los EBs se hundan hasta el fondo de los pozos. Retire el medio viejo sin secar los EB de modo que unos 0,2 mililitros de medio viejo permanezcan en cada pozo.
Añadir 3 mililitros por pozo de nuevo medio humano PGCLC, después de retirar el medio antiguo todos los días. Para identificar los PGCLC humanos como células OCT4 positivas, cosecha los EBs a un tubo de microcentrífuga de unión baja de 1,5 mililitros. Deje que los EBs se hundan hasta el fondo a temperatura ambiente y deseche el medio.
Enjuague los EBs con hielo frío 1X PBS. Después de retirar el PBS, incubar los EBs en 1 mililitro de hielo frío 1%peso en volumen azida sódica en PBS en hielo durante cinco minutos. Deje que los EBs se hundan hasta el fondo a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, enjuague los EB con PBS helado. Descongelar 200 microlitros de proteína de matriz extracelular sobre hielo. Agregue la proteína al tubo que contiene los EB.
Deje el tubo a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos, hasta que el gel esté solidificado y los EB estén incrustados. Para fijar los EBs, agregue 1 mililitro de 4%formaldehído en PBS al tubo, e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos con un suave balanceo. Después de eso, deseche el formaldehído y enjuague los EB una vez con PBS frío.
Añadir 1 mililitro de 70%etanol. Almacenar en 70%etanol a 4 grados Celsius por hasta una semana, o proceder a procesarlos con un protocolo FFPE estándar. La densidad celular y la distribución uniforme de las células en cada pozo son fundamentales.
Los IPSC humanos en 2 mililitros de Y27632 suplementados medio por pozo de una placa de seis pozos, alcanzan 20 a 30% de confluencia después de 24 horas. Después de un cultivo adicional de 24 horas en el medio mTeSR1, en ausencia de Y27632, las células se sumaron y formaron colonias, ocupando aproximadamente el 30% del área de crecimiento. Después de 24 horas de cultivo en el medio de reprogramación 4i, las células alcanzaron la confluencia.
Después de 24 horas adicionales de cultivo en el medio 4i, las células se volvieron más densamente embaladas. Después de una incubación de 24 horas en micropocillos en el medio de reprogramación 4i, las células formaron EBs con su contorno circular visible a las 24 a 30 horas después de la inoculación. Los EB mantenidos en el medio humano de LA PGCLC, en condiciones no adherentes, mantuvieron su forma esférica sin agregación después de 24 horas.
Después de 192 horas, los EBs eran más grandes, manteniendo la misma morfología. Después de 5 días, las células surgieron como OCT4 que expresa las células en la superficie de los EBs, aumentando su número después de 8 días. Las células de la suspensión de una sola célula de los PGCL humanos fueron enriquecidas como células CD38 positivas por FACS.
Las células que no expresan CD38 fueron un control negativo. Para evitar la contaminación, las puertas FACS CD38-positivas y CD38-negativas se separaron por un amplio margen. Al intentar este procedimiento, es importante seguir el conteo exacto de celdas y los tiempos de cambio medio.
Omitir el cambio medio incluso un solo día, o reducir el volumen de ese medio en cualquier paso, puede causar la muerte masiva de células. La velocidad del cultivo de balanceo de los cuerpos embrionados tiene que ser cuidadosamente optimizada.
