Las IPSC de primates son útiles pero a menudo difíciles de obtener debido a cuestiones éticas y técnicas. Este protocolo proporciona una ruta más accesible para la generación y el mantenimiento de IPSC de primates. El uso de células urinarias como fuente primaria de IPSC tiene una gran ventaja, ya que se pueden obtener de una manera completamente no invasiva sin ninguna técnica especial.
Demostrando el procedimiento estará Jessica Radmer, estudiante de doctorado de Wolfgang M.S.Laboratory. Para comenzar, centrifugar el tubo que contiene orina a 400 G durante 10 minutos. Luego aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro en el tubo y vuelva a suspender el pellet en él.
Lave las células agregando 10 mililitros de tampón de lavado de orina que contenga anfotericina y mezcle cuidadosamente la suspensión con una pipeta serológica. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente menos de 0,2 mililitros en el tubo. Resuspender el pellet celular en un mililitro de medio urinario primario que contenga anfotericina por 50 mililitros de orina procesada inicialmente.
Retire la gelatina y agregue un mililitro de la suspensión en un pocillo de gelatina recubierto de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Para preparar una matriz de membrana basal recubierta de 12 pocillos, agregue 500 microlitros de matriz de membrana basal por pozo.
Mueva la placa para distribuir el líquido e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, reemplace la matriz de la membrana basal con 900 microlitros de medio REMC y guárdela a 37 grados centígrados hasta su uso. Calcule el volumen de virus Sendai necesarios para una multiplicidad de infección de cinco usando la ecuación.
Descongele rápidamente los componentes del kit de reprogramación Sendai en el baño de agua templado a 37 grados centígrados. Agregue el medio REMC para un total de 100 microlitros a un tubo antes de agregar el volumen calculado de virus Sendai y mezclar. Después de la disociación de las células urinarias como se describe en el manuscrito, cuente las células usando el contador de células y transfiera el número deseado de células a un tubo de 1,5 mililitros.
Obtener el pellet por centrifugación y resuspenderlo en 100 microlitros de la mezcla preparada del virus Sendai. Incubar el tubo durante una hora a 37 grados centígrados para la infección de la suspensión. Después de la incubación, agregue REMC a un total de un mililitro antes de sembrar la suspensión celular en la matriz de membrana basal recubierta con la placa de 12 pocillos.
Después de la transducción, cambie el medio cada dos días hasta el desarrollo de colonias de células madre pluripotentes inducidas, o IPSC, con el cambio al medio de generación de PSC en el quinto día. Cuando las colonias de IPSC crezcan lo suficientemente grandes como para el paso de grumos, aspire el medio de las células cultivadas y lave cuidadosamente las células con 500 microlitros de DPBS. Después de retirar el DPBS, agregue 500 microlitros de EDTA 0.5 milimolar al pozo e incube durante dos a cinco minutos.
Observe cuidadosamente las células bajo el microscopio hasta que las colonias comiencen a desprenderse. Cuando los bordes de las colonias comiencen a desprenderse y los espacios entre las células se hagan visibles, retire el EDTA y agregue cuidadosamente 500 microlitros de DPBS. Aspirar el DPBS y enjuagar el pozo con 500 microlitros de medio de cultivo PSC utilizando una pipeta P-1000.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo para dispersar las colonias en grupos de tamaño apropiado. Dependiendo de la confluencia, la densidad deseada de las células sembradas y la preferencia clonal IPSC, transfiera 1/10 a 1/50 de la suspensión del grupo celular a los nuevos pocillos. Mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás varias veces para distribuir los grupos uniformemente en el pozo.
Incubar la placa durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados para dejar que los grupos se adhieran. Cambie el medio cada dos o tres días hasta que las colonias crezcan lo suficiente como para pasar. Después del aislamiento, se pueden ver células escamosas y varias células redondas más pequeñas que se excretaron con la orina.
Se pueden ver las primeras células adherentes en proliferación, y estas células se convierten en grandes colonias que pueden pasar. Se pueden ver dos tipos de células distintas, una con un fenotipo epitelial y la otra que muestra un fenotipo más mesenquimal con forma alargada. Después del primer paso, las células urinarias crecen como una monocapa.
Durante la generación de IPSC, se pueden ver algunas células adherentes y estas células comienzan a mostrar cambios morfológicos, lo que indica la reprogramación de las células. Además, las células que forman colonias muestran la morfología típica de células madre embrionarias. Todas las IPSC generadas comparten la morfología típica de colonia similar a una célula madre embrionaria, caracterizada por células apretadas con bordes claramente definidos.
Se utilizó inmunocitoquímica para probar la expresión de marcadores asociados a la pluripotencia en IPSC de gorila. Además, el análisis de citometría de flujo mostró que las IPSC de orangutanes analizadas son positivas para TRA-1-60. Además, los IPSC de gorila son capaces de diferenciarse en linajes de endodermo, mesodermo y ectodermo.
Un mayor número de celdas diferenciadas y una pérdida de integridad y uniformidad de los límites indican una mala calidad del IPSC. Por el contrario, los bordes definidos, el empaquetamiento celular hermético y los nucléolos prominentes significan IPSC de alta calidad. Debido a la variabilidad coronal, es necesario optimizar las condiciones específicas del clon, como la relación de división, el tiempo de paso y el tamaño del grupo para mantener las IPSC de primates creciendo sanas.
Como controles de calidad de las IPSC establecidas, se puede verificar la prepotencia mediante la inducción de diferenciación directa o indirecta, como la diferenciación de EV in vitro, además de verificar la expresión génica marcadora.
