L'obiettivo di questo semplice sistema biomimetico biomimetico a base cellulare 3D è quello di facilitare l'analisi della capacità di invasione in una grande popolazione di sferoidi tumorali per lo screening anti-metastatico dei farmaci. Il vantaggio principale del nostro array di micro-camere idrogel è che consente la produzione di un gran numero di sferoidi uniformi che popolano lo stesso piano focale per pozzo. La posizione dello sferoide viene mantenuta grazie alla struttura dell'array di microcamera dell'idrogel anche dopo l'aggiunta della matrice extracellulare, facilitando l'accurato monitoraggio continuo degli sferoidi e del processo di invasione.
Inoltre, la caratterizzazione morfologica e la colorazione fluorescente di numerosi sferoidi e cellule invasori possono essere eseguite in situ e analizzate con una risoluzione a singolo elemento in modo efficiente in termini di tempo. A dimostrare la procedura di produzione di lastre di imaging a sei pozzi hydrogel micro-chamber array sarà Maria Sobolev del nostro laboratorio. Per preparare le piastre di array a microcamera dell'idrogel, preriscaldare prima sei polidimetilsilossano, o PDMS, timbra a 70 gradi Celsius e posizionare una piastra inferiore in vetro a sei pozzi su un bagno asciutto preriscaldato a 75 gradi Celsius per diversi minuti.
Quando la piastra è calda, versare una goccia di 400 microliter di agarosio preriscaldato a bassa fusione sul fondo di ogni pozzo della piastra a sei pozzetto e posizionare delicatamente un timbro su ogni goccia. Lasciare raffreddare la configurazione per cinque-10 minuti a temperatura ambiente, seguita da 20 minuti a quattro gradi Celsius per la gelazione completa dell'agarosio. Quando l'agarosio si è solidificato, staccare delicatamente il PDMS da ogni pozzo, lasciando i gel di agarosio modellati con micro-camere.
Dopo aver permesso alla lampada UV di raggiungere la sua massima intensità, posizionare la piastra goffrata nel sistema di polimerizzazione della luce per tre minuti e riempire i macro-pozzi sterilizzati uv con PBS sterile. Quindi, coprire la piastra e avvolgerla con Parafilm per una conservazione di quattro gradi Celsius fino all'uso. Per caricare le celle, rimuovere il PBS da ogni pozzo e caricare delicatamente 50 microlitri delle cellule di interesse sopra ogni array di idrogel.
Dopo aver permesso alle cellule di depositarsi per gravità per 15 minuti, aggiungere con cura da sei a otto aliquote di 500 microlitri di mezzo fresco al bordo del fondo di plastica macro-pozzo all'esterno dell'anello e dell'array di idrogel. Incubare le cellule per il periodo di tempo appropriato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità per la formazione di sferoidi. Quindi, trasferire gli sferoidi in una cappa di biosicurezza sul ghiaccio per 10 minuti.
Quando la piastra si è raffreddata, appoggiare una punta di pipetta sul bordo del fondo di plastica macro-pozzo accanto all'array di idrogel e rimuovere tutto il mezzo da tutto l'array. Quindi, rimuovere il mezzo dal serbatoio dell'array, appoggiare con molta attenzione una punta della pipetta a caricamento in gel sul bordo del serbatoio dell'array, facendo attenzione a non disturbare le micro-camere e gli sferoidi. Successivamente, utilizzare una punta di pipetta fine pre-congelata per aggiungere due aliquote di 150 microlitri della miscela di collagene di interesse sul bordo dell'array una alla volta, rilasciando lentamente la miscela per evitare la lussazione dello sferoide.
Dopo che il secondo ciclo di collagene è stato aggiunto ad ogni pozzo, riportare gli sferoidi nell'incubatrice per un'ora per la gelazione completa della matrice extracellulare. Quando la matrice si è solidificata, aggiungere 400 microlitri di agarosio pre-riscaldato a bassa fusione dell'1% sopra il gel e incubare la piastra, coperta a temperatura ambiente, per cinque-sette minuti, prima di raffreddare per due minuti a quattro gradi Celsius per la gelazione dell'agarosio. Quindi, appoggiando la pipetta sul bordo del fondo in plastica macro-pozzo, aggiungere delicatamente due millilitri di mezzo completo ad ogni pozzo.
Per eseguire un test di invasione, caricare la piastra array a microcamera dell'idrogel su uno stadio di microscopio invertito motorizzato dotato di un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% con un'atmosfera umidificata e utilizzare un obiettivo quattro o 10x per pre-determinare le posizioni per l'acquisizione dell'immagine in ogni pozzo in modo da valutare l'intera area dell'array. Quindi, acquisisci immagini a campo luminoso ogni due o quattro ore per un totale di 24-72 ore per monitorare l'invasione cellulare dal corpo dello sferoide nella matrice extracellulare circostante. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, esportare le immagini time-lapse dal software di acquisizione delle immagini per il salvataggio in un formato di file di immagine con tag in una cartella dedicata.
Aprire quindi l'interfaccia utente grafica e fare clic su Carica campo luminoso. Regolate i parametri di segmentazione dell'immagine per ottenere una segmentazione precisa degli sferoidi e delle loro aree di invasione, quindi fate clic su Segmentazione regione di interesse (Region Of Interest Segmentation) per creare un bordo attorno a ogni sferoide. Se la segmentazione automatica non è corretta, premere CANC o Aggiungi e apportare manualmente le correzioni appropriate.
Fate clic su Tracciamento (Tracking) per numerare gli sferoidi in ciascuna delle immagini time-lapse. Quindi, fare clic su Misurazione per generare un foglio di calcolo con tutti i parametri e salvare il foglio di calcolo in un formato appropriato per l'elaborazione dei dati e l'analisi statistica. Per esaminare l'influenza dell'acido ialuronico sul processo spontaneo di invasione sferoide HeLa, in questo esperimento, gli sferoidi maturi due giorni sono stati coperti con soluzione di miscela di collagene e acido ialuronico e confrontati con sferoidi maturi due giorni coperti solo con soluzione di collagene.
Dopo 50 ore di incubazione, gli sferoidi incorporati nel collagene e nell'acido ialuronico hanno dimostrato una minore dispersione cellulare nella matrice extracellulare circostante rispetto agli sferoidi incorporati nel solo collagene. Infatti, l'analisi della cinetica dell'area di invasione nel tempo per 99 sferoidi a risoluzione a sferoide singolo indica chiaramente che l'aggiunta di acido ialuronico al collagene inibisce la dispersione cellulare fuori dalla sferoide, con conseguente aree di invasione più piccole. Il trattamento della coltura di sferoidi HeLa con un flavonoide bioattivo con proprietà cito-emigratiche per 24 ore si traduce in una dispersione cellulare inibita intorno agli sferoidi rispetto agli sferoidi HeLa non trattati.
Infatti, l'analisi delle aree di invasione di 488 sferoidi alla fine dell'esperimento ha rivelato una significativa inibizione dopo il trattamento con appena 10 micromolari del farmaco. A causa della bassa caratteristica di attacco dell'idrogel, questa tecnologia a base di microcamera facilita la formazione di sferoide anche in casi di pochissime cellule. Questo è particolarmente utile nei preziosi campioni di cellule primarie a staminali tumorali o derivati dal paziente.
La piastra di imaging a microcamera idrogel consente l'analisi dell'esatta posizione spaziale degli sferoidi durante gli esperimenti a lungo termine per la valutazione del processo di invasione a livello di singolo elemento e fornisce un alto grado di robustezza statistica e precisione. Le applicazioni future di questa metodologia includono la coltivazione multi-cellula affiancata di cellule tumorali e stromali in diverse regioni all'interno del macro-pozzo e il recupero di singoli sferoidi per l'analisi molecolare a valle.
