この単純な再現性バイオミメティック3D細胞系システムの目標は、抗転移性薬物スクリーニングのための腫瘍スフェロイドの大規模集団における浸潤能力分析を容易にすることである。当社のヒドロゲルマイクロチャンバアレイの主な利点は、ウェルごとに同じ焦点面を取り込む多数の均一なスフェロイドの製造を可能にすることです。スフェロイド位置は、細胞外マトリックス添加後もヒドロゲルマイクロチャンバアレイ構造に起因して保持され、スフェロイドおよび浸潤プロセスの正確な連続的なモニタリングを容易にする。
また、多数のスフェロイドや細胞に侵入する形態的特徴付けや蛍光染色を現場で行い、時間効率の高い方法で単一元素分解能で解析することができます。ヒドロゲルマイクロチャンバーアレイ6ウェルイメージングプレートの製造手順を実証することは、当研究室のマリア・ソボレフです。ヒドロゲルマイクロチャンバーアレイプレートを準備するには、まず6つのポリジメチルシロキサン(PDMS)を70°Cにスタンプし、6ウェルのガラス底板を乾いたお風呂に置き、数分間摂氏75度に予熱します。
プレートが暖かい場合は、6ウェルプレートの各ウェルの底に400マイクロリットルの予熱低融解アガロースを注ぎ、各滴の上に1つのスタンプをそっと置きます。セットアップを室温で5〜10分間冷却し、続いて摂氏4度で20分冷却し、完全なアガロースゲル化を行います。アガロースが固まったら、各ウェルからPDMSを穏やかに剥がし、マイクロチャンバーでパターン化されたアガロースゲルを残します。
UVランプが最高強度に達した後、エンボス加工されたプレートを光硬化システムに3分間置き、UV殺菌されたマクロウェルに無菌PBSを充填します。その後、プレートを覆い、使用するまで4°Cの保存のためにパラフィルムで包みます。細胞をロードするには、各ウェルからPBSを取り除き、各ヒドロゲルアレイの上に対象の細胞の50マイクロリットルを静かにロードします。
細胞が重力で15分間沈着した後、リングとヒドロゲルアレイの外側のマクロウェルプラスチック底部の縁に、新鮮な培地の500マイクロリットルの6〜8個のアリコートを慎重に追加します。セルを適時 37 度でインキュベートし、スフェロイドを形成するために湿度が 5%の二酸化炭素を使用します。その後、スフェロイドを氷上のバイオセーフティフードに10分間移します。
プレートが冷却されたら、ハイドロゲルアレイの隣にあるマクロウェルプラスチック底部の端にピペットチップを傾け、アレイの周りからすべての媒体を取り除きます。次に、アレイタンクから培地を取り出し、配列タンクの端部にゲルローディングピペットチップを非常に注意深く傾け、マイクロチャンバとスフェロイドを乱さない様に注意してください。次に、予め冷凍された細かいピペットチップを使用して、配列の端に目的のコラーゲン混合物の150マイクロリットルの2つのアリコートを1つずつ加え、スフェロイド脱臼を避けるためにゆっくりと混合物を放出する。
コラーゲンの第2ラウンドが各ウェルに加えられた後、細胞外マトリックスの完全なゲル化のために1時間インキュベーターにスフェロイドを戻す。マトリックスが固まったら、ゲルの上に予温1%低融解アガロースアガロース400マイクロリットルを加え、室温で覆われたプレートを5〜7分間インキュベートしてから、アガロースゲル化のために摂氏4度で2分間冷却します。その後、マクロウェルプラスチック底部の端にピペットを傾け、各ウェルに完全な培地の2ミリリットルを静かに加える。
浸潤アッセイを実行するには、加湿雰囲気を有する37°Cと5%の二酸化炭素インキュベーターを備えた電動反転顕微鏡ステージにハイドロゲルマイクロチャンバーアレイプレートをロードし、4または10倍の目的を使用して各ウェルの画像取得の位置を事前に決定し、アレイ領域全体を評価します。次に、2~4時間ごとに2~4時間毎に明視野画像を取得し、スフェロイド体から周囲の細胞外マトリックスへの細胞浸潤を追跡します。画像取得の終了時に、タグ付き画像ファイル形式で保存するための画像取得ソフトウェアからタイムラプス画像を専用フォルダにエクスポートします。
次に、グラフィックユーザーインターフェイスを開き、[明視野のロード]をクリックします。イメージのセグメンテーション パラメータを調整して、回転楕円体とその侵入領域の正確なセグメンテーションを実現し、[対象領域セグメンテーション]をクリックして各回転楕円体の周囲に境界を作成します。自動セグメンテーションが正しくない場合は、Delete または Add を押して、適切な修正を手動で行います。
[トラッキング] をクリックして、各タイムラプス 画像の回転楕円体に番号を付けます。次に、[測定] をクリックしてすべてのパラメータを含むスプレッドシートを生成し、データ処理と統計分析に適した形式でスプレッドシートを保存します。ヒアルロン酸が自発的なHeLaスフェロイド浸潤過程に及ぼす影響を調べるために、この実験では、2日間熟成したスフェロイドをコラーゲンおよびヒアルロン酸混合物溶液で覆い、コラーゲン溶液単独で覆われた2日間成熟したスフェロイドと比較した。
50時間のインキュベーションの後、コラーゲンとヒアルロン酸に埋め込まれたスフェロイドは、コラーゲン単独に埋め込まれたスフェロイドと比較して、周囲の細胞外マトリックスへの低い細胞分散を実証した。実際、単一スフェロイド分解能での99個のスフェロイドに対する経時の浸潤領域の反応の分析は、コラーゲンへのヒアルロン酸の添加がスフェロイドからの細胞分散を阻害し、より小さな浸潤領域をもたらすことを明確に示している。細胞およびミグラスタティック特性を有する生物活性フラボノイドを用いたHeLaスフェロイド培養の処理は、非処理HeLaスフェロイドと比較して、スフェロイドの周りの細胞分散を阻害する結果となる。
実際、実験終了時の488個のスフェロイドの浸潤領域の分析は、わずか10マイクロモルの薬物で治療後に有意な阻害を明らかにした。ヒドロゲルの添付ファイル特性が低いため、このマイクロチャンバベースの技術は、非常に少数の細胞の場合でもスフェロイドの形成を容易にします。これは、貴重な限られた癌幹細胞様または患者由来の初等細胞サンプルにおいて特に有利である。
ヒドロゲルマイクロチャンバイメージングプレートは、単一要素レベルでの浸潤プロセスの評価のための長期実験中にスフェロイドの正確な空間位置を分析し、高度な統計的堅牢性と精度を提供します。この方法論の将来の応用には、マクロウェル内の異なる領域における腫瘍および間質細胞の並んで多細胞培養および下流の分子解析のための個々のスフェロイドの検索が含まれる。
