Цель этой простой воспроизводимой биомиметической 3D-клеточной системы заключается в облегчении анализа способности к вторжению в большую популяцию сфероидов опухоли для скрининга антиметастатических препаратов. Основным преимуществом нашего гидрогеля микрокамерного массива является то, что он позволяет производство большого количества однородных сфероидов, которые населяют ту же фокусную плоскость на колодец. Положение сфероида сохраняется благодаря структуре микрокамерного массива гидрогеля даже после добавления внеклеточной матрицы, облегчая точный непрерывный мониторинг сфероидов и процесс вторжения.
Кроме того, морфологическая характеристика и флуоресцентное окрашивание многочисленных сфероидов и вторгающихся клеток могут быть выполнены на месте и проанализированы в одном элементном разрешении эффективным способом. Демонстрацией гидрогелевого микрокамерного массива шестиявежелой процедуры производства пластин будет Мария Соболева из нашей лаборатории. Чтобы подготовить гидрогель микро-камеры массив пластин, сначала разогреть шесть polydimethylsiloxane, или PDMS, штампы до 70 градусов по Цельсию, и место шесть хорошо, стекло-дно пластины на сухой ванне предварительно нагревается до 75 градусов по Цельсию в течение нескольких минут.
Когда тарелка теплая, залить 400-микролитер капли предварительно нагретых низкоплавильных агарозы на дно каждого хорошо из шести хорошо пластины, и аккуратно поместите одну печать над каждой каплей. Разрешить установки для охлаждения в течение пяти до 10 минут при комнатной температуре, а затем 20 минут при четырех градусах по Цельсию для полного агарозного гелеобразования. Когда агароза затвердеет, аккуратно снимите PDMS с каждой хорошо, оставляя агарозы гели узорчатые с микро-камер.
После того, как УФ-лампа достигнет своей наивысшей интенсивности, поместите тиснение пластины в системе легкого лечения в течение трех минут, и заполнить УФ-стерилизованных макро-колодцев с стерильной PBS. Затем накройте пластину и оберните ее Parafilm для четырехградсового хранения по Цельсию до использования. Чтобы загрузить клетки, удалите PBS из каждой хорошо, и осторожно загрузить 50 микролитров клеток, представляющих интерес на вершине каждого гидрогеля массива.
После того, как клетки оседают под действием силы тяжести в течение 15 минут, осторожно добавьте от шести до восьми алицитов 500 микролитров свежей среды к краю макро-хорошо пластикового дна за пределами кольца и гидрогеля массива. Инкубировать клетки в течение соответствующего периода времени при 37 градусах цельсия и 5%углекислого газа с влажностью для образования сфероидов. Затем перенесите сфероиды в капюшон биобезопасности на льду в течение 10 минут.
Когда пластина остынет, наклонитесь наконечник пипетки на краю макро-хорошо пластикового дна рядом с массивом гидрогеля, и удалить все среды со всего массива. Затем, удалить среду из бака массива, опереться гель-загрузки пипетки отзыв на краю массива бак очень тщательно, заботясь, чтобы не беспокоить микро-камер и сфероидов. Затем используйте предварительно замороженный, тонкий наконечник пипетки, чтобы добавить две алициты из 150 микролитров коллагеновой смеси, представляющих интерес на краю массива по одному, выпуская смесь медленно, чтобы избежать вывиха сфероидов.
После того, как второй раунд коллагена был добавлен в каждый колодец, вернуть сфероиды в инкубатор в течение одного часа для полного гелеобразования внеклеточной матрицы. Когда матрица затвердеет, добавьте 400 микролитров предварительно разогретой 1%низкоплавильной агарозы поверх геля и инкубировать пластину, покрытую при комнатной температуре, в течение пяти-семи минут, перед охлаждением в течение двух минут при четырех градусах Цельсия для агарозного гелеобразования. Затем, опираясь пипетку на краю макро-хорошо пластикового дна, аккуратно добавить два миллилитров полной среды к каждому хорошо.
Для проведения анализа вторжения загрузите гидрогельную микрокамерную массивную пластину на моторизованную перевернутую стадию микроскопа, оснащенную 37-градусным цельсием и 5%-ным инкубатором двуокиси углерода с увлажненной атмосферой, и используйте четырех- или 10-х цель для предварительного определения позиций для получения изображения в каждой хорошо, так что вся площадь массива будет оценена. Затем, приобрести яркие поля изображения каждые два-четыре часа в общей сложности от 24 до 72 часов, чтобы отслеживать вторжение клеток из сфероидного тела в окружающую внеклеточную матрицу. В конце приобретения изображения экспортут изображения замедленного действия из программного обеспечения для приобретения изображений для сохранения в формате файла с тегами в специальную папку.
Затем откройте графический пользовательский интерфейс и нажмите Load Bright Field. Отрегулируйте параметры сегментации изображения, чтобы достичь точной сегментации сфероидов и областей их вторжения, и нажмите Регион Сегментации интересов, чтобы создать границу вокруг каждого сфероида. Если автоматическая сегментация неверна, нажмите Удалить или Добавить, и внести соответствующие исправления вручную.
Нажмите Отслеживание, чтобы знать сфероиды в каждом из изображений замедленного действия. Затем нажмите Измерение, чтобы создать электронную таблицу со всеми параметрами, и сохранить таблицу в соответствующем формате для обработки данных и статистического анализа. Для изучения влияния гиалуроновой кислоты на спонтанный процесс нашествия сфероидов HeLa, в этом эксперименте, двухдневные созревают сфероиды были покрыты коллагеном и раствором смеси гиалуроновой кислоты и по сравнению с двухдневными созревает сфероиды покрыты коллагеновым раствором в одиночку.
После 50 часов инкубации сфероиды, встроенные в коллаген и гиалуроновую кислоту, продемонстрировали более низкую дисперсию клеток в окружающую внеклеточную матрицу по сравнению со сфероидами, встроенными только в коллаген. Действительно, анализ кинетики области вторжения с течением времени для 99 сфероидов в односферном разрешении ясно показывает, что добавление гиалуроновой кислоты к коллагену подавляет рассеивание клеток из сфероида, что приводит к меньшим областям вторжения. Лечение сфероидной культуры HeLa биоактивным флавоноидом с цито- и миграстатическими свойствами в течение 24 часов приводит к ингибированию дисперсии клеток вокруг сфероидов по сравнению с необработанные сфероиды HeLa.
Действительно, анализ зон вторжения 488 сфероидов в конце эксперимента выявил значительное торможение после лечения всего 10 микромолерами препарата. Из-за низкой привязанности, характерной для гидрогеля, эта технология на основе микрокамер облегчает образование сфероидов даже в очень немногих клетках. Это особенно преимущество в ценных ограниченных раковых стволовых или пациентов, полученных первичных образцов клеток.
Гидрогелевая микрокамерная томография позволяет анализировать точное пространственное расположение сфероидов в ходе длительных экспериментов по оценке процесса вторжения на уровне одного элемента и обеспечивает высокую степень статистической достоверности и точности. Будущие применения этой методологии включают бок о бок многоклеточное культивирование опухолевых и стромальных клеток в различных регионах в пределах макро-хорошо и поиск отдельных сфероидов для вниз по течению молекулярного анализа.
