Bu basit tekrarlanabilir biyomimetik 3D hücre tabanlı sistemin amacı anti-metastatik ilaç taraması için tümör küresel büyük nüfus invazyon kapasite analizini kolaylaştırmaktır. Hidrojel mikro-oda dizimizin en büyük avantajı, kuyu başına aynı odak düzlemini dolduran çok sayıda üniforma lı küresel liğin üretimine olanak sağlamasıdır. Küresel pozisyon, hücre dışı matris ilavesi sonrasında bile hidrojel mikro oda cıkı dizi yapısı sayesinde korunur ve küresel lerin ve istila sürecinin doğru sürekli izlenmesini kolaylaştırır.
Ayrıca, çok sayıda küresel ve istilacı hücrenin morfolojik karakterizasyonu ve floresan boyama yerinde yapılabilir ve zaman etkin bir şekilde tek elemanlı çözünürlükte analiz edilebilir. Hidrojel mikro odadizisini gösteren altı kuyulu görüntüleme plakası üretim prosedürü laboratuvarımızdan Maria Sobolev olacaktır. Hydrogel mikro odacık dizi plakaları hazırlamak için, ilk ön ısıtma altı polidimetilsiloksane, veya PDMS, 70 santigrat dereceye pullar, ve kuru bir banyo üzerinde altı iyi, cam alt plaka yerleştirin önceden ısıtılmış 75 derece santigrat birkaç dakika.
Plaka sıcak olduğunda, altı kuyulu plakanın her bir kuyunun dibine 400 mikrolitrelik bir damla önceden ısıtılmış düşük eritme agarose dökün ve her damlanın üzerine hafifçe bir pul yerleştirin. Tam agarose jelasyon için dört santigrat derece 20 dakika takip, oda sıcaklığında beş ila 10 dakika soğumasını bekleyin kurulum. Agarose katılaşmış olduğunda, yavaşça her kuyudan PDMS soyma, mikro-odaları ile desenli agarose jelleri bırakarak.
UV lambasının en yüksek yoğunluğa ulaşmasına izin verdikten sonra, kabartmalı plakayı üç dakika boyunca ışık kür sistemine yerleştirin ve UV sterilize edilmiş makro kuyuları steril PBS ile doldurun. Daha sonra, plakakapağı ve parafilm ile dört derece santigrat depolama için kullanıma kadar sarın. Hücreleri yüklemek için, PBS'yi her kuyudan çıkarın ve her hidrojel dizisinin üzerine 50 mikrolitre lik ilgi hücrelerini nazikçe yükleyin.
Hücrelerin 15 dakika boyunca yerçekimiile yerleşmesine izin ettikten sonra, halka ve hidrojel dizisinin dışındaki makro kuyudaki plastik alt kenarına 500 mikrolitre taze ortam dan altı ila sekiz aliquot ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksit ile nem ile uygun bir süre için kuluçkaya yatırın. Sonra, küreselleri 10 dakika lığına buz üzerinde biyogüvenlik kaputuna aktarın.
Plaka soğuduğunda, hidrojel dizisinin yanındaki makro kuyudaki plastik alt kısıma bir pipet ucu yerleştirin ve tüm ortamı dizinin çevresinden çıkarın. Daha sonra, dizi tankından orta yı çıkarın, mikro odaları ve küresel leri rahatsız etmemeye özen taslayarak, dizi tankının kenarına jel yüklemeli pipet ucunu çok dikkatli bir şekilde yerleştirin. Daha sonra, bir dizi kenarında ilgi kollajen karışımı 150 mikrolitre iki aliquots eklemek için önceden dondurulmuş, ince pipet ucu kullanın, küresel çıkık önlemek için karışımı yavaş yavaş serbest.
Kollajen ikinci tur her kuyuya eklendikten sonra, ekstrasellüler matris tam jelasyon için bir saat için kuvöz için küresel döndürün. Matris katılaşmış olduğunda, jel üstüne önceden ısıtılmış% 1 düşük erime agarose 400 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında kaplı plaka, beş ila yedi dakika, agarose jelasyon için dört derece santigrat iki dakika soğutma önce kuluçka. Daha sonra, makro iyi plastik alt kenarına pipet eğilerek, yavaşça her kuyuya tam orta iki mililitre ekleyin.
Bir istila tayini yapmak için, hidrojel mikro oda dizi plakasını 37 derecesi santigrat derece ve %5 karbondioksit inkübasyonu ile nemlendirilmiş bir atmosfere sahip motorlu ters mikroskop aşamasına yükleyin ve her kuyudaki görüntü ediniminin konumlarını önceden belirlemek için dört veya 10 x'lik bir hedef kullanın, böylece tüm dizi alanı değerlendirilecektir. Daha sonra, her iki ila dört saatte bir, küresel vücuttan çevredeki hücre dışı matrisiçine hücre istilasını izlemek için toplam 24 ila 72 saat boyunca parlak alan görüntüleri elde edin. Görüntü edinme nin sonunda, etiketli görüntü dosyası biçiminde nisbeten özel bir klasöre kaydetmek için görüntü edinme yazılımındaki hızlandırılmış görüntüleri dışa aktarın.
Ardından, grafik kullanıcı arabirimini açın ve Parlak Alanı Yükle'yi tıklatın. Spheroidlerin ve istila alanlarının kesin bir bölümlemasını sağlamak için görüntünün segmentasyon parametrelerini ayarlayın ve her küresel oidin etrafında bir kenarlık oluşturmak için İlgi Alanı Segmentasyonu'nu tıklatın. Otomatik segmentasyon yanlışsa Sil veya Ekle'ye basın ve uygun düzeltmeleri el ile yapın.
Hızlandırılmış görüntülerin her birinde küresel sayıları numaralandırmak için İzleme'yi tıklatın. Ardından, tüm parametreleri içeren bir elektronik tablo oluşturmak ve elektronik tabloyu veri işleme ve istatistiksel analiz için uygun biçimde kaydetmek için Ölçüm'ü tıklatın. Hyaluronik asitin spontan HeLa küresel invazyon süreci üzerindeki etkisini incelemek için, bu deneyde, iki günlük olgunlaşmış küresel oidler kollajen ve hyaluronik asit karışımı çözeltisi ile kaplanmış ve kollajen solüsyonu ile kaplanmış iki günlük sferoidlerle karşılaştırıldı.
Kuluçka 50 saat sonra, kollajen ve hyaluronik asit gömülü küresel oidler kollajen tek başına gömülü küresel matris ile karşılaştırıldığında çevreleyen ekstrasellüler matris içine daha düşük bir hücre dağılımı gösterdi. Gerçekten de, tek küresel çözünürlükte 99 küresel oidiçin zaman içinde istila alanı kinetik analizi açıkça kollajen hyaluronik asit eklenmesi küresel hücre dağılımını inhibe gösterir, küçük istila alanları ile sonuçlanan. HeLa küresel kültürünin biyoaktif flavonoid ile 24 saat boyunca sito ve migrastatik özellikleri ile tedavisi, tedavi edilmeyen HeLa küresellerine kıyasla sferoidlerin etrafında hücre dağılımının inhibe edilmesiyle sonuçlanır.
Gerçekten de, deney sonunda 488 spheroidin istila alanlarının analizi, ilacın 10 mikromolar kadar az bir ile tedaviden sonra önemli bir inhibisyon ortaya koymuştur. Hidrojelin düşük bağlanma özelliği nedeniyle, bu mikro oda tabanlı teknoloji çok az hücre örneklerinde bile küresel oluşumunu kolaylaştırır. Bu değerli sınırlı kanser kök gibi veya hasta kaynaklı birincil hücre örneklerinde özellikle avantajdır.
Hidrojel mikro-oda görüntüleme plakası, istila sürecinin tek element düzeyinde değerlendirilmesi için uzun süreli deneyler sırasında küresellerin tam mekansal konumlarının analizini sağlar ve yüksek derecede istatistiksel sağlamlık ve doğruluk sağlar. Bu metodolojinin gelecekteki uygulamaları makro-iyi içinde farklı bölgelerde tümör ve stromal hücrelerin yan yana çok hücreli kültürve downstream moleküler analiz için bireysel küresel oidlerin alınması içerir.
