Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la composición y organización dinámica de los complejos de proteínas fotosintéticas en la membrana tilakoide vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis de interacciones funcionales entre complejos proteicos nativos y aclara la plasticidad de la organización del complejo proteico en diferentes condiciones ambientales. Configure las placas de 10 centímetros de la rueda de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando espaciadores de 0,75 milímetros.
Coloque un mezclador de gradiente en una placa de agitación y conéctelo con la bomba peristáltica en tubo. Coloque una aguja de jeringa en el otro extremo del tubo y coloque la aguja entre el vidrio y la placa de aluminio. Coloque un agitador magnético en la cámara pesada.
Preparar soluciones de 3,5% y 12,5% de acrilamida en tubos de centrífuga cónica de 15 mililitros, tal como se detalla en el protocolo de texto que se utilizará para el gradiente de gel de separación. Para evitar la polimerización prematura, mantenga los tubos centrífugos sobre hielo mientras prepara las soluciones. Agregue 5%APS y TEMED justo antes de pippetar las soluciones al mezclador de gradiente.
Pipetear las soluciones del 12,5% a la cámara pesada. Retire las burbujas de aire del canal que conecta la cámara ligera y pesada abriendo la válvula que conecta las dos cámaras permitiendo que la solución entre a la cámara de luz. Cierre la válvula y pipetee los restos de la solución de vuelta a la cámara pesada.
Por último, pipetear la solución del 3,5% a la cámara de luz. Encienda el agitador magnético. Abra las válvulas y encienda la bomba peristáltica.
Permita que las soluciones de gel fluyan entre el vidrio y la placa de aluminio a un caudal de aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. La aguja debe estar por encima del líquido en todo momento. Cuando las cámaras pesadas y ligeras se hayan vaciado llénalas con agua ultrapura.
Y deje que el agua superponga suavemente la superficie del gel. La polimerización en gel tarda aproximadamente una o dos horas a temperatura ambiente. Preparar la solución de 3% de acrilamida para el gel de apilamiento a temperatura ambiente.
Pipetear el gel de apilamiento en la parte superior del gel de separación polimerizado y colocar un peine de gel de muestra entre el vidrio y la placa de aluminio evitando las burbujas de aire. Después de permitir que el gel se polimerice durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, retire el peine suavemente bajo agua ultrapura. En este punto el gel se puede almacenar a cuatro grados Celsius positivos en condiciones húmedas durante unos días.
Diluir los tilakoids aislados con un tampón 25BTH20G helado a una concentración final de clorofila de un miligramo por mililitro. Preparar dos tubos para cada muestra de tilakoide para realizar solubilización de beta-DM y digitonina. Ahora agregue un volumen igual de detergente tampón.
Mezcle suavemente el detergente y el tilakoide con una pipeta y evite hacer burbujas de aire. Solubilizar los tilakoids durante dos minutos en hielo para la solubilización beta-DM. O 10 minutos a temperatura ambiente con mezcla suave y continua en un balancín o agitador para la solubilización de digitónína.
Después de la incubación, retire el material insolubilizado por centrifugación a 18.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados positivos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y añada 1/10 volumen de búfer azul brillante coomassie a la muestra. Configure el gel en un sistema de electroforesis vertical.
Llene la cámara tampón superior con tampón de cátodo azul y vierta el tampón de ánodo a la cámara tampón inferior. Cargue las muestras de tilakoide en los pozos. Inicie la electroforesis y aumente gradualmente la tensión indicada en el protocolo de texto.
Ejecute el gel a cuatro grados centígrados positivos, ya sea utilizando una sala fría o ajustando la temperatura del gel con un sistema de refrigeración. Cambie el búfer de cátodo azul a un búfer de cátodo transparente cuando el frente de la muestra haya migrado aproximadamente 1/3 del gel. Después de la ejecución electroforética escanear el gel con un escáner de fotos para el archivado de imágenes.
Para realizar 2-SDS PAGE montar el sistema de electroforesis vertical utilizando espaciadores de un milímetro. Prepare un gel SDS estándar con un peine 2D como se describe en el protocolo de texto. Corte el carril del gel BN y colóquelo en un tubo de cinco mililitros.
A continuación, agregue dos mililitros de tampón de Laemmli e incubar la tira durante 45 minutos con un suave temblor a temperatura ambiente. Coloque el carril con la ayuda de un espaciador en la parte superior del gel evitando burbujas de aire. Pipetear cinco microlitros de marcador de peso molecular en un trozo estrecho de papel de filtro y colocar el papel en el pozo estándar.
Para sellar la tira de gel BN y el papel marcador verter un 0.5% de agarosa en tampón de funcionamiento en la parte superior de la tira de gel y dejar que se solidifique. Realizar electroforesis de acuerdo con los protocolos estándar. Después de la carrera electroforética visualizar las proteínas con mancha de rubí SUPRO o tinción de plata.
Aquí se muestran los resultados representativos de patrones complejos de proteína tilakoide de muestras beta-DM y digitonina-solubilizadas. Los pequeños complejos migran más rápido durante la carrera electroforética y, por lo tanto, están en la parte inferior del gel. Mientras que los grandes complejos están en la parte superior del gel.
La digitonina generalmente preserva los complejos proteicos en conjuntos más grandes, mientras que la DM beta interfiere con las interacciones proteína-proteína lábil entre los complejos. Aquí se presenta la composición de la subunidad de los complejos proteicos de los tilakoids beta-DM y digitonina-solubilizados. Las subunidades de cada complejo se encuentran a partir de la línea vertical por debajo del complejo alineado.
En principio, cada punto en el gel 2-D representa una proteína individual. Pero en la práctica, varias proteínas de la misma masa molecular pueden estar presentes en un solo punto. La identificación de las manchas se basa en el análisis de espectrometría de masas.
Después de aplicar este procedimiento se puede continuar con otros métodos como la microscopía electrónica y el análisis de partículas únicas de los complejos proteicos eluidos del gel nativo azul con el fin de obtener información estructural sobre los complejos proteicos. Para identificar subunidades de proteínas desconocidas, las manchas de proteína individuales de SDS PAGE bidimensionales se pueden analizar con especificaciones de masa. No olvide que trabajar con acrilamida y digitonina puede ser extremadamente dañino y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes protectores durante la realización de este procedimiento.
