Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la toxicología de insectos y la fisiología de insectos midiendo la electrogénesis del sistema nervioso central Drosophila melanogaster. Esto permite probar una amplia gama de hipótesis científicas y ayudar en el descubrimiento de nuevos modos de acción insecticida. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un sistema simple, reproducible y relativamente alto rendimiento con un mínimo de insumo financiero para estudiar el sistema nervioso de Drosophila.
Para empezar, abra el software de adquisición/análisis. Haga clic en Configurar en la barra de herramientas principal y seleccione Configuración de canal, que abrirá un cuadro de diálogo. Reduzca el número de canales totales a tres.
El canal uno grabará la señal cruda del amplificador con un rango de 100 milivoltios. El canal dos se utilizará para contar el número de eventos del canal uno que están por encima de un umbral determinado. Para ello, haga clic en la pestaña Cálculo para abrir un menú desplegable para el canal dos.
Seleccione Mediciones cíclicas, que abrirá un segundo cuadro de diálogo. Seleccione el canal uno como origen. A continuación, en la medida del menú desplegable, seleccione Pico de unidad en eventos.
Por último, en el área de configuración de detección, en el menú desplegable, seleccione Umbral simple. El nivel de umbral se introduce en la ventana de ajuste de detección que se establecerá por encima del ruido de fondo. Para convertir la actividad eléctrica en una gráfica de velocidad expresada en hercios, seleccione Aritmética en el tercer canal.
En la nueva ventana, introduzca 1000 veces smoothsec, paréntesis canal dos comas dos. A continuación, seleccione en el menú desplegable de unidades los hercios de la unidad de frecuencia. Cierre los cuadros de diálogo para volver a la pantalla principal.
El eje Y del canal tres debe expresarse en hercios y en el eje X en el tiempo. Diseccionar la larva Drosophila CNS identificando y extrayendo primero un Drosophila melanogaster errante de tercera estrella del vial de cultivo y colocándolo en 200 microlitros de solución salina. Luego, agarra los ganchos de la boca con un par de fórceps finos, y agarra el abdomen del gusano con un segundo par de fórceps, con ligera presión, para evitar romper la fina capa cuticular.
Tire suavemente de los ganchos de la boca y el abdomen en diferentes direcciones para separar el extremo caudal del gusano de la región de la cabeza y exponer las vísceras del gusano. El SNC se entrelazará con la tráquea y el tracto digestivo. Saca el SNC fuera del tracto digestivo y la tráquea con fórceps.
La disección del sistema nervioso central De Drosophila del gusano es un paso crítico para el éxito. Los ganglios diseccionados deben estar intactos, sin ningún daño significativo a los nervios motores descendentes. Un mayor número de nervios motores unidos a los ganglios aumentará las frecuencias de disparo basales.
Si es necesario, interrumpa la barrera hematoencefálica transectando manualmente el SNC posterior a los lóbulos cerebrales con tijeras de resorte Vannas. La transección debe realizarse sobre la base de las propiedades fisioquímicas del producto químico utilizado. La línea roja es el punto de transección sugerido y el SNC transectado con troncos nerviosos periféricos descendentes intactos que se muestran aquí.
Para empezar, primero tire del electrodo de pipeta de vidrio de los capilares de vidrio borosilicato a una resistencia de cinco a 15 megamios. Inserte el SNC transectado en una cámara de cera que contenga 200 microlitros de solución salina. Sujete un pasador de insecto sin recubrimiento con un clip de cocodrilo soldado al cable de tierra e inserte el pasador en la solución salina para completar el circuito.
Usando los micromanipuladores, oriente el electrodo hacia el extremo caudal del SNC transectado. Elimine el ruido de fondo ajustando el nivel de umbral en el software de adquisición/análisis antes de conectar los troncos nerviosos periféricos. Aplique una ligera presión negativa sobre la jeringa para atraer los nervios periféricos al electrodo de aspiración.
Inicie la grabación en el software de adquisición de datos y la velocidad de disparo de línea base se equilibre durante cinco minutos antes de recopilar los datos de la velocidad de disparo de línea de base. Después de cinco minutos, agregue 200 microlitros de solución salina y vehículo para llevar el volumen total de la cámara a 400 microlitros para comenzar a registrar las tasas de disparo de control. Deseche la preparación y el registro si el patrón de disparo del tratamiento de control no es similar al ejemplo que se muestra aquí.
Cuando se haya establecido la línea de base después de tres a cinco minutos de registro, retire 200 microlitros de solución salina y añada 200 microlitros del agente experimental solubilizados en solución salina. Etiquetar este punto de tiempo de aplicación de drogas en el software de adquisición / análisis mediante la inclusión de un comentario que incluye el medicamento y la concentración final. Aquí se muestra un rastro representativo de secreción nerviosa antes y después de la exposición a DMSO.
La flecha indica la hora de aplicación. Se observa una respuesta limitada a DMSO. El aumento de las dosis de propoxur amplificó la frecuencia de descarga de picos del SNC Drosophila transectado de una manera dependiente de la concentración, mientras que el GABA neurodepresor redujo la frecuencia de descarga de picos de una manera dependiente de la concentración.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que es un experimento ex vivo, y por lo tanto las condiciones de la solución salina, como el pH y la temperatura, es fundamental para la actividad prolongada de la preparación del sistema nervioso central. Del mismo modo, la falta de actividad eléctrica acarneada, una jaula faraday eficaz y una reducción del ruido de 60 hercios son fundamentales para el éxito de este ensayo. Los datos recopilados a través de este ensayo pueden ayudar a identificar el modo específico de acción de los insecticidas.
Se puede realizar la validación posterior de estos datos a través de otros métodos, como la electrofisiología de la abrazadera de voltaje, los análisis bioquímicos y los ensayos farmacológicos adicionales.
