이 방법은 Drosophila 멜라노가스터 중추 신경계의 전기 발생을 측정하여 곤충 독성학 및 곤충 생리학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 1개의 과학적인 가설의 넓은 범위를 시험하고 행동의 새로운 살충제 모드의 발견에 원조하는 것을 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 Drosophila의 신경계를 연구하기 위해 최소한의 재정적 입력으로 간단하고 재현 가능하며 상대적으로 높은 처리량 시스템을 제공한다는 것입니다.
시작하려면 수집/분석 소프트웨어를 엽니다. 기본 도구 모음에서 설정을 클릭하고 대화 상자가 열리는 채널 설정을 선택합니다. 총 채널 수를 3개로 줄입니다.
채널 1은 앰프의 범위100 밀리볼트로 원시 신호를 기록합니다. 채널 2는 지정된 임계값보다 높은 채널 1의 이벤트 수를 계산하는 데 사용됩니다. 이를 위해 계산 탭을 클릭하여 채널 2의 드롭다운 메뉴를 엽니다.
두 번째 대화 상자를 여는 순환 측정값을 선택합니다. 채널 하나를 소스로 선택합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴 측정에서 이벤트에서 단위 스파이크를 선택합니다.
마지막으로 드롭다운 메뉴에서 검색 설정 영역에서 간단한 임계값을 선택합니다. 임계값 수준은 배경 노이즈 위에 설정될 감지 조정 창에 입력됩니다. 전기 활동을 헤르츠에 표현된 속도 플롯으로 변환하려면 세 번째 채널에서 산술을 선택합니다.
새 창에서 입력 1000 배 smoothsec, 괄호 채널 2 쉼표 2. 그런 다음 단위 드롭다운 메뉴에서 주파수 단위 hertz를 선택합니다. 대화 상자를 닫고 메인 화면으로 돌아갑니다.
채널 3의 y축은 헤르츠와 x축으로 제 시간에 표현되어야 합니다. 처음 식별하고 문화 유리병에서 방황 세 번째 별 Drosophila 멜라노가스터를 추출하여 애벌레 Drosophila CNS를 해부하고 식염수의 200 마이크로 리터에 배치. 그런 다음, 미세 한 개의 포셉으로 입 후크를 잡고, 얇은 큐티큘러 층을 찢어 방지하기 위해, 가벼운 압력, 집게의 두 번째 쌍으로 구더기의 복부를 잡아.
구더기의 코달 끝을 머리 부위에서 분리하고 구더기의 내장을 노출하기 위해 입 후크와 복부를 다른 방향으로 부드럽게 당깁니다. CNS는 기관및 소화관과 얽혀있을 것입니다. 분개로 소화관과 기관에서 CNS를 애타게합니다.
구더기에서 드로소필라 중추 신경계의 해부는 성공을위한 중요한 단계입니다. 해부된 신경은 내림차순 모터 신경에 큰 손상없이 그대로해야합니다. 신경리에 부착 된 모터 신경의 큰 숫자는 기준선 발사 주파수를 증가시킬 것이다.
필요한 경우, 수동으로 반나스 봄 가위로 뇌 엽에 CNS 후방을 위장하여 혈액 뇌 장벽을 중단. 편절제술은 사용되는 화학 물질의 생리적 특성에 기초하여 수행되어야한다. 레드 라인은 제안된 트랜섹션 포인트와 여기에 표시된 말초 신경 트렁크가 있는 방제 된 CNS입니다.
먼저 유리 파이펫 전극을 보로실리케이트 유리 모세혈관에서 5~15메가옴의 저항성으로 끌어당깁니다. 200 마이크로리터의 식염수를 포함하는 왁스 챔버에 간질 CNS를 삽입합니다. 코팅되지 않은 곤충 핀을 접지 와이어로 납땜한 악어 클립으로 고정하고 핀을 식염수에 삽입하여 회로를 완성합니다.
마이크로 조작기를 사용하여, 전극을 과기 CNS의 caudal 끝으로 방향을 지정합니다. 주변 신경 트렁크를 연결하기 전에 획득/분석 소프트웨어의 임계값 수준을 조정하여 배경 잡음제거합니다. 흡입 전극에 말초 신경을 그리려면 주사기에 약간의 음압을 가하십시오.
데이터 수집 소프트웨어에서 레코딩을 시작하고 기준 발사 속도는 기준 발사 속도 데이터를 수집하기 전에 5분 동안 평형화합니다. 5분 후, 식염수와 차량의 200 마이크로리터를 추가하여 챔버의 총 부피를 400 마이크로리터에 가져와 제어 발사 속도를 기록합니다. 대조군 처리의 발사 패턴이 여기에 표시된 예와 유사하지 않은 경우 준비 및 기록을 폐기한다.
3~5분 동안 기준선이 설정된 경우 식염수 200마이크로리터를 인출하고 식염수로 용해된 실험제의 마이크로리터 200을 추가합니다. 약물 및 최종 농도를 포함하는 코멘트를 포함시킴으로써 취득/분석 소프트웨어에서 약물 응용의 이 시간 지점에 레이블을 지정합니다. 여기에 DMSO에 노출되기 전과 후에 대표적인 신경 방출 흔적이 있습니다.
화살표는 응용 프로그램의 시간을 나타냅니다. DMSO에 대한 제한된 응답이 보입니다. 프로톡소르의 투여량이 증가함에 따라 주사된 드로소필라 CNS의 스파이크 배출 빈도가 농도 의존적인 방식으로 증폭되는 반면, 신경우울제 GABA는 농도 의존적 방식으로 스파이크 배출 빈도를 감소시켰다.
이 절차를 시도하는 동안, 그것은 전 생체 내 실험임을 기억하는 것이 중요합니다, 따라서 pH와 온도와 같은 식염수의 조건은 중추 신경계 준비의 장기간 된 활동에 중요하다. 마찬가지로, 외부 전기 활동의 부족, 효과적인 패러데이 케이지, 그리고 60 헤르츠 소음의 감소는이 분석의 성공에 매우 중요합니다. 이 분석서를 통해 수집된 데이터는 살충제의 특정 행동 모드를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
전압 클램프 전기생리학, 생화학 분석 및 추가 약리학적 분석과 같은 다른 방법을 통해 이러한 데이터의 후속 검증을 수행할 수 있다.
