Los dispositivos microfluídicos utilizados para compartimentar las neuronas se han convertido en una herramienta estándar en neurociencia, lo que permite a los investigadores manipular física y químicamente las regiones subcelulares de las neuronas, incluyendo somata, axones, dendritas y sinapsis. Estos dispositivos de cultivo compartimentados pueden ayudar a responder numerosas preguntas en el campo de la neurociencia, tales como, cómo los axones se extienden durante el desarrollo para formar sinapsis, cómo las sinapsis se remodelan y reforman después del daño de axón y cómo las condiciones patológicas pueden propagarse transsinápticamente en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer. Este protocolo describe el uso de chip multicompartimento de plástico preensamblado para compartimentar las neuronas de rata primarias de cultivo.
La principal ventaja de usar estas virutas es que proporcionan un método fácil de usar y altamente reproducible para compartimentar las neuronas. Otra ventaja es que estos chips producen un crecimiento más saludable y a largo plazo de neuronas y axones aislados que los dispositivos compartimentados basados en silicio anteriores y son igualmente compatibles con la microscopía de alta resolución. Otros sistemas modelo, incluidas las células madre humanas, también pueden ser cultivados dentro del chip de compartimentación premontado.
Para empezar, coloque un chip estéril y multicompartimento en un plato de Petri. Añadir 100 microlitros de una solución de precodificación al pozo superior izquierdo del chip y permitir que fluya a través del canal principal en el pozo contiguo. A continuación, llene el pozo inferior izquierdo del chip con 100 microlitros de la solución de precodificación.
Esta vez, espere cinco minutos para permitir que la solución fluya a través de las micro-grooves. Ahora, agregue 100 microlitros de la solución de precodificación al pozo superior derecho y permita que fluya a través del canal principal hacia el pozo contiguo. Después de 90 segundos, llene el pozo inferior derecho con 100 microlitros de la solución de precodificación e incubar el chip durante 10 minutos.
Angulo cuidadosamente la punta de la pipeta, lejos del canal principal y aspirar la solución de cada pozo. Luego, agregue inmediatamente 150 microlitros de PBS al pozo superior izquierdo y espere un minuto y medio. A continuación, agregue 150 microlitros de PBS al pozo inferior izquierdo y espere cinco minutos para permitir que el líquido fluya a través de las micro-grooves.
A continuación, agregue 150 microlitros de PBS a los pozos superior derecho e inferior derecho, en ese orden. Después de 10 minutos, aspirar de nuevo el PBS y repetir los pasos de lavado una segunda vez. Después del segundo lavado, aspirar el PBS de los pozos como antes mediante la pesca de la punta de la pipeta, lejos de la abertura del canal.
A continuación, añadir 100 microlitros de 0,5 mezcla por mil solución de poli-D-lisina, al pozo superior izquierdo del chip. Espere un minuto y medio y luego llene el pozo inferior izquierdo con 100 microlitros de la solución de poli-D-lisina. Repita este proceso en la mitad derecha del chip.
Cierre el plato de Petri. A continuación, coloque el chip en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, enjuague el chip dos veces con PBS como se describió anteriormente.
A continuación, aspire el PBS desde el dispositivo. Inmediatamente, agregue 100 microlitros de medios de cultivo celular al pozo superior izquierdo del chip. Después de un minuto y medio, agregue medios al pozo inferior izquierdo.
Espere cinco minutos para permitir que los medios fluyan a través de las micro-grooves y luego repita el proceso de llenado en el lado derecho del chip. Preparar una suspensión celular de las neuronas hipocampales de rata disociada de acuerdo con los protocolos establecidos. Retire la mayoría de los medios en cada pozo del chip, pero deje los canales llenos.
A continuación, cargue inmediatamente cinco microlitros de la suspensión celular en el pozo superior derecho y otros cinco microlitros de suspensión celular en el pozo inferior derecho. Al cargar las celdas, apunte la punta de la pipeta hacia el canal principal. Después de cargar las células, transfiera el chip a una etapa del microscopio y para asegurarse de que las neuronas están en el canal principal.
Después de esperar cinco minutos para que las células se adhieran, agregue aproximadamente, 150 microlitros de medios de cultivo neuronal a cada uno de los pozos superiores e inferiores derecho. A continuación, agregue 150 microlitros de medios a cada uno de los pozos superiores e inferiores a la izquierda. Cubra el plato Petri y coloque el chip en una bandeja humidificada en una incubadora de 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados.
En primer lugar, retire 20 microlitros del pozo inferior izquierdo del compartimiento axonal y colóquelo en el pozo superior derecho del compartimento somático. Espere dos minutos para que el flujo dentro de cada canal se equilibre. A continuación, retire 50 microlitros de medios del compartimiento axonal y agregue 0,3 microlitros de un milimolar Alexa Fluor 488 hydrazide a este medio.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución y luego devolver el medio que contiene el tinte fluorescente de nuevo en el compartimiento axonal. En este punto, coloque el chip en el microscopio y la imagen como desee. Para realizar la axotomía dentro del chip, primero, retire el medio del compartimiento axonal, manteniendo la punta de la pipeta lejos de la entrada del canal principal.
Guarde los medios eliminados en un tubo centrífugo por ahora. A continuación, coloque la pipeta de aspiración cerca, ya sea la entrada del canal principal del compartimiento axonal y aspire completamente el compartimiento axonal. Continúe aspirando el área durante uno o dos minutos.
Sustituya el compartimiento axonal por el soporte almacenado. Asegúrese de que la solución se retira completamente del compartimiento y de que los axones estén cortados mirando la muestra bajo un microscopio. Luego, cubra el chip y devuélvalo a la incubadora.
Para comenzar la inmunosuchación por fluorescencia, retire la mayoría de los medios del chip, manteniendo los compartimentos interiores hidratados. Inmediatamente, añadir 100 microlitros de solución de fijación a los pozos superiores de los compartimentos axonales y somáticos. Después de un minuto, agregue 100 microlitros de solución de fijación a los pozos inferiores y fije las celdas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Retire la mayor parte de la solución de los pozos e inmediatamente, agregue 150 microlitros de PBS a cada uno de los pozos superiores de los compartimentos axonales y somáticos. Espere dos minutos hasta que el PBS fluya en los pozos inferiores, luego, retire el PBS y enjuague los pozos dos veces más usando este mismo proceso. Después del último enjuague, retire la mayor parte del PBS de los pozos del chip e inmediatamente, agregue 150 microlitros de PBS con 0.25%tritón x-100 a cada uno de los pozos superiores de los compartimentos axonales y somáticos.
Espere 15 minutos y luego, retire la mayor parte del líquido de los pozos. Inmediatamente, añadir 150 microlitros de solución de bloqueo a cada uno de los pozos superiores de los compartimentos axonales y somáticos. Después de 15 minutos, retirar la mayor parte del líquido de los pozos e inmediatamente, añadir 100 microlitros de la solución de anticuerpos primarios, a cada uno de los pozos superiores de los compartimentos axonales y somáticos.
Cubra el chip para minimizar la evaporación e incubar las células en el anticuerpo primario durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, enjuague el chip retirando la mayor parte de la solución e inmediatamente añadiendo 150 microlitros de PBS a cada uno de los pozos superiores de los compartimentos axonal y semático. Después de cinco minutos, retire el PBS de ambos pozos y repita el enjuague dos veces más.
Ahora, retire la mayor parte del líquido de los pozos e inmediatamente, agregue 100 microlitros de anticuerpos secundarios en PBS, a cada uno de los pozos superiores de los compartimentos axonal y somático. Cubra el chip para minimizar la evaporación e incubar el chip durante una hora a temperatura ambiente. Como se muestra anteriormente, enjuague el chip tres veces con PBS, monte e imagen los chips como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña.
Aquí se muestra una comparación en paralelo de las neuronas cultivadas en chips de plástico y dispositivos PDMS. El crecimiento neuronal es comparable dentro de las dos plataformas hasta 15 días en el cultivo, pero a edades de cultivo más largas, los axones aislados dentro del chip de plástico, parecen más saludables con menos golpes. Para visualizar aún más los axones dentro de los compartimentos axonales, estas muestras también fueron inmunotendéradas para la tubulina beta III, que muestra un crecimiento axonal saludable dentro de las virutas de plástico a los 22 días en el cultivo.
Otras manchas con muestras de 24 días muestran neuronas cultivadas en las virutas de plástico para expresar los marcadores sinápticos excitatorios e inhibitorios, vGlut1 y vGat. Aquí están los dos marcadores sinápticos combinados con neuronas mCherry retrógradas etiquetadas. Para demostrar la idoneidad de este chip para los estudios de lesión y regeneración de axón, antes se tomaron imágenes de neuronas retrógradas etiquetadas y 24 horas después de la axotomía.
Una bombilla de retracción y un axón regenerador son evidentes después de la axotomía. Estos resultados son equivalentes a los datos publicados mediante dispositivos basados en PDMS. Los chips multicomparte clásicos proporcionan una opción fácil de usar para compartimentar las neuronas que proporcionan cultivos de neuronas a largo plazo, que siguen siendo viables durante más de tres semanas.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar sembrar el número adecuado de neuronas y asegurarse de que su incubadora está bien humidificada durante el cultivo.
