Dispositivos microfluidos usados para compartimentar neurônios tornaram-se uma ferramenta padrão na neurociência, permitindo aos pesquisadores manipular física e quimicamente regiões subcelulares de neurônios, incluindo somata, axônios, dendritos e sinapses. Esses dispositivos de cultura compartimentalizados podem ajudar a responder inúmeras perguntas no campo da neurociência, como, como os axônios se estendem durante o desenvolvimento para formar sinapses, como as sinapses remodelam e reformam após danos causados pelo axônio e como as condições patológicas podem se propagar transsintamente em doenças como o Alzheimer. Este protocolo descreve o uso de chip multicompartiment plástico pré-remontado para compartimentar neurônios primários de ratos de cultura.
A principal vantagem do uso desses chips é que eles fornecem um método fácil de usar e altamente reprodutível para compartimentar neurônios. Outra vantagem é que esses chips produzem um crescimento mais saudável e de longo prazo de neurônios e axônios isolados do que dispositivos compartimentados anteriores à base de silício e são igualmente compatíveis com microscopia de alta resolução. Outros sistemas modelo, incluindo células-tronco humanas, também são capazes de ser cultivados dentro do chip de compartimentalização pré-remontado.
Para começar, coloque um chip estéril e multicompartiment em uma placa de Petri. Adicione 100 microliters de uma solução de pré-codificação ao poço superior esquerdo do chip e permita que ele flua através do canal principal para o poço adjacente. Em seguida, encha o poço inferior esquerdo do chip com 100 microliters da solução de pré-codificação.
Desta vez, espere cinco minutos para permitir que a solução flua através das micro-ranhuras. Agora, adicione 100 microliters da solução de pré-codificação ao poço de pré-direita e permita que ele flua através do canal principal para o poço adjacente. Após 90 segundos, encha bem a parte inferior direita com 100 microliters da solução de pré-codificação e incubar o chip por 10 minutos.
Angule cuidadosamente a ponta da pipeta, longe do canal principal e aspire a solução de cada poço. Em seguida, adicione imediatamente 150 microliters de PBS ao poço superior esquerdo e espere um minuto e meio. Em seguida, adicione 150 microliters de PBS ao poço inferior esquerdo e espere cinco minutos para permitir que o líquido flua através das micro-ranhuras.
Em seguida, adicione 150 microliters de PBS aos poços superior-direito e inferior-direito, nessa ordem. Após 10 minutos, aspira novamente o PBS e repita os passos de lavagem uma segunda vez. Após a segunda lavagem, aspire o PBS dos poços como antes, angling a ponta pipeta, longe da abertura do canal.
Em seguida, adicione 100 microliters de 0,5 mix por solução de Poli-D-Lysine mil, ao poço superior esquerdo do chip. Espere um minuto e meio e depois encha bem a parte inferior esquerda com 100 microliters da solução Poly-D-Lysine. Repita este processo na metade direita do chip.
Feche a placa de Petri. Em seguida, coloque o chip em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, enxágue o chip duas vezes com PBS como descrito anteriormente.
Em seguida, aspire o PBS do dispositivo. Imediatamente, adicione 100 microliters de mídia de cultura celular ao poço superior esquerdo do chip. Depois de um minuto e meio, adicione mídia ao poço inferior esquerdo.
Aguarde cinco minutos para permitir que a mídia flua através dos micro-sulcos e, em seguida, repita o processo de enchimento no lado direito do chip. Prepare uma suspensão celular de neurônios hipocampais de ratos dissociados de acordo com protocolos estabelecidos. Remova a maioria das mídias em cada poço do chip, mas deixe os canais preenchidos.
Em seguida, carregue imediatamente cinco microliters da suspensão celular no poço superior-direito e outros cinco microliters de suspensão celular no poço inferior-direito. Ao carregar as células, aponte a ponta da pipeta para o canal principal. Depois de carregar as células, transfira o chip para um estágio de microscópio e para ter certeza de que os neurônios estão no canal principal.
Depois de esperar cinco minutos para as células anexarem, adicione aproximadamente 150 microliters de mídia de cultura neuronal a cada um dos poços superior e inferior direito. Em seguida, adicione 150 microliters de mídia a cada um dos poços superior e inferior esquerdo. Cubra a placa de Petri e coloque o chip em uma bandeja umidificada em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono, 37 graus Celsius.
Primeiro, remova 20 microliters do poço inferior esquerdo do compartimento axonal e coloque-o no poço superior-direito do compartimento somático. Aguarde dois minutos para que o fluxo dentro de cada canal se equilibre. Em seguida, remova 50 microliters de mídia do compartimento axonal, e adicione 0,3 microliters de um mililitro Alexa Fluor 488 hidrazida a esta mídia.
Pipeta para cima e para baixo para misturar a solução e, em seguida, retornar a mídia contendo o corante fluorescente de volta para o compartimento axonal. Neste ponto, coloque o chip no microscópio e na imagem conforme desejado. Para realizar axotomia dentro do chip, primeiro, remova a mídia do compartimento axonal, mantendo a ponta da pipeta longe da entrada do canal principal.
Armazene a mídia removida em um tubo de centrífuga por enquanto. Em seguida, coloque a pipeta de aspiração perto, seja a entrada do canal principal do compartimento axonal e aspire completamente o compartimento axonal. Continue aspirando a área por um a dois minutos.
Substitua o compartimento axonal pela mídia armazenada. Certifique-se de que a solução seja completamente removida do compartimento e os axônios sejam cortados olhando para a amostra sob um microscópio. Em seguida, cubra o chip e devolva-o à incubadora.
Para começar a imunossurreirência de fluorescência, remova a maior parte da mídia do chip, mantendo os compartimentos internos hidratados. Imediatamente, adicione 100 microliters de solução de fixação aos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Após um minuto, adicione 100 microliters de solução de fixação aos poços inferiores e fixe as células por 30 minutos em temperatura ambiente.
Remova a maior parte da solução dos poços e, imediatamente, adicione 150 microliters de PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Aguarde dois minutos para que o PBS flua para os poços inferiores, então, remova o PBS e enxágue os poços mais duas vezes usando este mesmo processo. Após a última lavagem, remova a maior parte do PBS dos poços do chip e, imediatamente, adicione 150 microliters de PBS com 0,25% triton x-100 para cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático.
Aguarde 15 minutos e, em seguida, remova a maior parte do líquido dos poços. Imediatamente, adicione 150 microliters de solução de bloqueio a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonais e somáticos. Após 15 minutos, remova a maior parte do líquido dos poços e, imediatamente, adicione 100 microliters da solução primária de anticorpos, a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático.
Cubra o chip para minimizar a evaporação e incubar as células no anticorpo primário por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue o chip removendo a maior parte da solução e adicionando imediatamente 150 microliters de PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e semático. Após cinco minutos, retire o PBS de ambos os poços e repita a lavagem mais duas vezes.
Agora, remova a maior parte do líquido dos poços e, imediatamente, adicione 100 microliters de anticorpos secundários em PBS, a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Cubra o chip para minimizar a evaporação e incubar o chip por uma hora em temperatura ambiente. Como mostrado anteriormente, enxágüe o chip três vezes com PBS em seguida, monte e imagem os chips como descrito no protocolo de texto que acompanha.
Mostrado aqui, é uma comparação lado a lado de neurônios cultivados em chips plásticos e dispositivos PDMS. O crescimento neuronal é comparável dentro das duas plataformas até 15 dias na cultura, mas em idades culturais mais longas, axônios isolados dentro do chip plástico, parecem mais saudáveis com menos batidas. Para visualizar ainda mais os axônios dentro dos compartimentos axonais, essas amostras também foram imunossuís para a beta tubulina III, que mostra crescimento axonal saudável dentro dos chips plásticos em 22 dias de cultura.
Outras manchas com amostras de 24 dias mostram neurônios cultivados nos chips plásticos para expressar tanto os marcadores sinápticos excitatórios e inibitórios, vGlut1 e vGat. Aqui estão os dois marcadores sinápticos combinados com neurônios mCherry retrógrados. Para demonstrar a adequação deste chip para estudos de lesão e regeneração de axônio, neurônios rotulados retrógrados foram imageados antes e 24 horas após a axotomia.
Uma lâmpada de retração e um axônio regenerador são ambos evidentes após a axotomia. Esses resultados equivalem aos dados publicados usando dispositivos baseados em PDMS. Chips multicompartimentos clássicos fornecem uma opção fácil de usar para neurônios compartimentais que fornecem culturas de neurônios de longo prazo, que permanecem viáveis por mais de três semanas.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de semear o número adequado de neurônios e certificar-se de que sua incubadora está bem umidificada durante a cultura.
