Las mitocondrias son esenciales para la salud neuronal. En muchas enfermedades neurodegenerativas, las mitocondrias axonales son las primeras en sufrir, pero no está claro qué hace que las mitocondrias axonales sean tan especiales. El gradiente de presión fluídica en las cámaras utilizadas en este protocolo permite el tratamiento selectivo de los axones mitocondriales.
Esto deja los procesos del cuerpo celular intactos y nos permite centrarnos en la biología axonal. Mostramos aquí la despolarización de las mitocondrias con un colorante sensible al potencial de membrana, pero este método se puede aplicar a muchos tipos diferentes de células neuronales y lecturas fluorescentes. Para comenzar, coloque las placas codificadas de seis pozos en una campana estéril y lávelas dos veces con agua estéril de doble destilación.
Deje que las placas se sequen en una posición inclinada durante tres a cinco minutos. Elimine el exceso de agua mediante succión al vacío o pipeteo. Luego remoje la cámara microfluídica en etanol al 80%.
Una vez más, seque la cámara microfluídica durante tres a cinco minutos en posición inclinada y elimine el exceso de etanol con una punta de pipeta. Cuando esté completamente seco, coloque la cámara microfluídica en el centro del pozo y la placa. Golpee suavemente la cámara microfluídica en sus bordes y la sección de microranura en el centro para una fijación adecuada a la placa de vidrio.
Primero, recoja el número deseado de neuronas disociadas del hipocampo en un tubo de reacción de 1.5 mililitros. Centrifugar el tubo a 1000 veces G durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en ocho microlitros de medios neurobasales B-27.
Luego dispense la solución celular en la entrada del canal de la cámara microfluídica. Toque la parte posterior de la placa para ayudar al flujo a través del canal. Usando una pipeta, aspirar cualquier suspensión celular restante a la salida del canal.
Incubar la cámara microfluídica con células durante 15 a 20 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, llene el pozo axonal superior con 50 microlitros de medios neurobasales B-27 y toque la parte posterior de la placa para ayudar al flujo. Llene cada pocillo en el lado del soma con 150 microlitros de medios neurobasales B-27, creando una burbuja de tensión en la parte superior.
También llenar ambos pocillos del lado axonal con 100 microlitros de medios neurobasales B-27 cada uno. Después de siete a ocho días de cultivo in vitro, asegúrese de que los axones hayan crecido a través de los microsurcos y se hayan extendido al compartimiento axonal. Lave el dispositivo retirando el medio neurobasal B-27 y agregando 100 microlitros de medio de imagen precalentado a los pocillos superiores de los canales axonal y soma.
Deje que el medio fluya a través de los pozos inferiores. Retire el medio de los pocillos inferiores y cualquier medio sobrante de los pocillos superiores, y repita con un medio fresco, dejando los pocillos vacíos al final del lavado. Luego agregue 100 microlitros de dilución TMRE de cinco nanomolares a los pocillos superiores somáticos y axonales.
Deje que el medio fluya a través de ambos compartimentos, hasta que haya un volumen igual en todos los pozos. Llene con el medio que contiene TMRE. Seleccione una región de interés en el compartimento somático y sígala a través de los microsurcos hasta el compartimiento axonal.
Asegúrese de que las microranuras fotografiadas en los compartimentos somático y axonal coincidan entre sí. Después de cambiar el nombre del archivo, adquiera imágenes de fluorescencia roja utilizando una excitación de 561 nanómetros y longitudes de onda de emisión de 625 nanómetros. Asegure una diferencia de volumen entre el soma y las cámaras axonales comprobando la presencia de una burbuja de tensión en el lado somático.
Luego retire el medio de imagen de ambos pocillos del lado axonal, excepto del medio dentro del canal. Para inducir la despolarización mitocondrial, agregue 160 microlitros de 20 micromolares antimicina A diluida en el medio de imagen al pocillo axonal superior. Deje que fluya a través del canal hasta que haya un volumen igual en ambos pocillos axonales.
Repita las imágenes, asegurándose de que se obtengan las mismas posiciones que durante la adquisición de referencia, identificando los microsurcos. Usando este protocolo, las neuronas primarias del hipocampo se cultivaron en dispositivos microfluídicos, seguidas de tinción mitocondrial con un colorante sensible a la membrana, TMRE. Se observó una tinción homogénea de las mitocondrias en ambos lados de los microsurcos, pero no en el medio.
Tras la adición de antimicina A al lado axonal, las mitocondrias somales retuvieron la señal TMRE, mientras que la fluorescencia se perdió de las mitocondrias axonales. Asegúrese de que no quede humedad en el pozo o en el dispositivo antes de ensamblar el dispositivo. De lo contrario, las cámaras no estarán selladas. Utilizando este método, podemos estudiar los efectos de la pérdida de la función mitocondrial en el axón y las funciones locales, así como su influencia en la señalización retrógrada y la supervivencia celular global.
Durante mucho tiempo se pensó que la biogénesis mitocondrial ocurría exclusivamente en el cuerpo celular. Este método nos permitió revelar que el daño axonal de las mitocondrias requería la traducción local de la proteína PINK1.
