Los autores desean agradecer Alexei Bogdanov para la fabricación de chips de patch-clamp en el CPFC y Hue Tran, Zhao Ping y Shiu Mateo para obtener ayuda con el montaje. Naweed Syed fue apoyada por un Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) subvención. Collin Luk es el receptor de NSERC y Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) becas de.

1. Fabricación de chips El proceso descrito en 6 resultados en un 3 m de espesor autónomo película, una baja resistencia acceso 1 Mohmio y una superficie lisa en forma de embudo abertura que facilita un sello íntimo con la célula 9, véase la Figura 2. Las virutas se singulated y pegadas en paquetes de plexiglás con la abertura hacia un agujero que conecta el chip a un canal subterráneo. El encolado se dispensa en un modo que se minimice la capacidad en paralelo a un nominal de 17 pF. Paquetes están equipados con dos mm de diámetro y 1,5 mm 6 tubos de vidrio largas como puertos fluídicos (Figura 3). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figura 2. Micrografía electrónica de barrido de una sección de haz de iones enfocado de una NRCC de patch-clamp de chips muestra una superficie lisa y de dióxido de silicio en forma de embudo que favorece los contactos íntimos de células, y un orificio poco profundo que representa una baja de acceso resistanccorreo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figura 3. Un chip está pegado a la parte inferior del frasco de cultivo en un paquete de plexiglás equipado con fluidos subterráneos y tubos de vidrio. 2. La esterilización, el cebado y pruebas Los siguientes pasos deben realizarse en una cabina de seguridad biología para evitar la contaminación o el taponamiento de la abertura. <ul type="disc"><li> Esterilizar fichas en un limpiador Harrick básica de plasma (www.harrickplasma.com) con una presión de aire residual 0.1-0.3 mbar durante 15 minutos a la máxima potencia de 18 W. Otros sistemas de aire de plasma puede ser utilizado, con una densidad de potencia comparables (24 mW / cm 3) y mantener el producto de la densidad de potencia y constante de tiempo. El tratamiento con plasma también hace que los chips hidrófilo, lo que facilita el cebado. </li><li> Colocar los tubos de vidrio con agua estéril tubo de silicona Silastic Laboratorio, 1 mm de diámetro interno x 2 mm OD (Cole ParmerCat. # 96115 hasta 08), 3inch en un lado, de 1 pulgada en el otro lado. </li><li> Llenar fluídica a través de los tubos con solución estéril filtrada estándar tampón fosfato (PBS), asegurándose de que ninguna burbuja está atrapado. </li><li> Sujete el tubo de silicona de largo, mientras que la presurización de la PBS desde el lado corto a 1 atm. Una piscina de PBS se filtra a través de la abertura puede ser visible en el vial. Sujete la fuente de presión de la PBS y desconecte el tubo de silicona pasos de que la oferta. </li><li> Llenar vial con filtrada PBS utilizando una jeringa. </li><li> Sumergir una Ag / Ag: electrodo Cl en el tubo corto y un contra-electrodo en el vial. Un medidor de impedancia se usa para confirmar que la resistencia de acceso es entre 300kohm y 3Mohm y la capacitancia de derivación está entre 10pF y 25 pF. Un chip con una menor resistencia es probable que tenga una fuga, y una capacidad mayor se considera inadecuado para su uso, ya que no pueden captar la dinámica de los más rápidos de la electrofisiología de la célula 6. Un chip con una capacidad menoro una mayor resistencia se considera enchufado, aunque podría ser simplemente que una burbuja queda atrapada en el orificio. Algunos chips se vuelven a prueba después de 1H y se encontró que la correcta impedancia electroquímica. </li><li> Enjuague bien el canal de fluidos con agua desionizada estéril, vaciar el frasco de la parte superior y enjuagar dos veces con la misma. </li><li> Sumergir el chip empaquetada con tubos en fresco agua desionizada estéril durante 30 minutos después cargar con otros chips en un recipiente estéril llena con agua desionizada estéril. Esto asegura que los chips de permanecer hidrófilo y protegido de la contaminación. </li></ul> 3. Chips de la preparación en el laboratorio de biología celular Los pasos siguientes se realizan en una campana de filtrado HEPA de flujo laminar utilizando técnicas asépticas, todas las soluciones que se utilizan en este procedimiento debe ser filtrada esterilizada antes de su uso mediante un filtro de 0.22μm. <ul type="disc"><li> Abrir un contenedor de astillas bajo una campana de filtrado HEPA de flujo laminar y retirar fichas de ContaINER boca abajo para evitar sacar posibles contaminantes flotantes en el vial de la parte superior. </li><li> Lavar la parte superior del frasco de 2x chip con recién filtrada agua desionizada estéril para eliminar los residuos de la superficie del chip. </li><li> Aspirar el agua desionizada estéril fuera del vial superior. </li><li> Conectar un extremo del tubo de Silastic unido al canal fluídico a una jeringa estéril a presión que contiene agua desionizada filtrada. En nuestro sistema, jeringas llenas de solución están presurizados por conexión a un tanque de aire comprimido a 20 psi establecido. Para asegurar la esterilidad, el aire es filtrado (0,22 micras filtro) antes de la entrada en la jeringa y nuestro sistema también tiene una válvula de encendido / apagado que nos permite detener o aplicar presión cuando sea necesario. </li><li> Utilizando una pinza hemostática, sujetar el extremo de salida de la tubería. </li><li> Abra el encendido / apagado para presurizar las válvulas de la solución. </li><li> Para enjuagar el fluídico subterranen del chip con fresca agua desionizada estéril, suelte el extremo de salida del tubo. </li><li> Para lace el agua hacia arriba a través de la abertura, sujetar el extremo de salida de la tubería con una pinza hemostática. </li><li> Para evitar el drenaje del agua, sujetar los extremos de entrada y salida de la tubería con una hemostatos y cerrar el encendido / apagado válvulas. </li><li> Separar el extremo de entrada del tubo de la jeringa. </li><li> Insertar los tapones de vidrio en ambos extremos de la tubería y eliminar las pinzas hemostáticas. </li><li> Llene la parte superior del vial con agua desionizada steriled filtro. </li><li> Colocar la tapa de un plato 35 mm estéril en la base de un plato 100 mm estéril </li><li> Colocar chip en la parte superior de la tapa 35 mm y cubierta con tapa 100 mm plato. </li><li> Chips de imagen para asegurar que la membrana y la abertura de los chips están libres de desechos y / o burbujas de aire. En nuestro laboratorio usamos un microscopio vertical y un largo 20x objetivo distancia de trabajo. </li><li> Si los desechos y / o burbujas de aire, lave varias veces de canal de fluidos y el vial superior. Si la suciedad y / o burbujas de aire no se puede quitar el chip se descarta. </li><li> Una vez que las virutas sonimágenes impresas, vuelva a la campana de flujo laminar y desenchufe los dos extremos de la tubería. </li><li> Una un extremo de la tubería a una jeringa a presión que contiene medios fisiológicos. </li><li> Fijar el extremo de salida de la tubería con una pinza hemostática </li><li> Abrir la válvula de presión, quitar el hemostato desde el extremo de salida de los fluidos y vaciar el canal fluídico con medios fisiológicos </li><li> Para enjuagar el fluídico subterráneo con medios fisiológicos, abrir el encendido / apagado válvulas y eliminar el hemostato desde el extremo de salida del tubo. </li><li> Para forzar los medios fisiológicos a través de la abertura, sujetar el extremo de salida de la tubería con una pinza hemostática. </li><li> Sujetar extremo de entrada del tubo con una pinza hemostática y cerrar el encendido / apagado válvulas. </li><li> Eliminar el extremo de entrada del tubo de la jeringa y el tapón ambos extremos de la tubería con tapones Glas. </li><li> Retire las pinzas hemostáticas. </li><li> Eliminar el agua del vial superior. </li><li> Llenar el vial con la parte superior del filtro esterilizado medios fisiológicos. </li><li>Vuelva a colocar el chip en la placa de Petri de 100 mm. </li><li> Coloque la base de un plato de 35 mm en el plato de 100 mm y llenarlo con filtro de agua desionizada esterilizada para enriquecer la humedad. </li><li> Cubra el plato hasta que sea tiempo para el revestimiento </li></ul> 4. Célula de recubrimiento de las neuronas de caracol Los chips de patch-clamp puede ser adecuado para una variedad de preparaciones. Actualmente estamos probando nuestras fichas con los mamíferos las neuronas corticales primarias y han obtenido resultados preliminares con células cultivadas durante 14 días 7, lo que indica que nuestro protocolo de esterilización es suficiente y que los chips no son citotóxicos en cultivos a largo plazo. A los efectos de este protocolo, las neuronas de los caracoles fueron escogidos porque representan un modelo simple, pero bien establecido para el estudio de electrofisiología neuronal 11, y es con las células que se han obtenido los resultados más significativos hasta la fecha 10. Aislamiento de células detallada y los procedimientos de la cultura tienenhan descrito anteriormente 12, 13. <ul type="disc"><li> Quite la cubierta exterior 2 a 3 meses de edad stagnalis Lymnaea con unas pinzas romas y los animales anestesiar en Lymnaea salina que contiene 10% de Listerine. Todas las etapas subsiguientes a cabo asépticamente dentro de una campana de flujo laminar con equipo esterilizado disección y soluciones a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva a colocar los medios fisiológicos en los fluidos con la solución de grabación de su caso, utilizando una pipeta de Eppendorf. En el caso de las neuronas Lymnaea la solución contiene (en mM): KCl 50, 5 MgCl 2, 5 etilenbis (oxietilenonitrilo) tetraacético (EGTA) y 4 5 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, pH 7,4 , 130 mOsm) 14 </li><li> Pin los caracoles en un plato lleno de Sylgard Lymnaea salina y eliminar todo el cerebro como se ha descrito previamente 13 </li><li> Tratar el aised cerebros en medios definidos (DM) con tripsina (0,2% de solución, Sigma, Catálogo # T-9201) durante 18 minutos, seguido por tratamiento en DM y el inhibidor de tripsina (Sigma, soja, Catálogo # T-9003) durante 15 minutos. </li><li> Pin el cerebro en un plato pequeño lleno de Sylgard alta osmolaridad define los medios de comunicación (HODM - DM con glucosa añadida, 750 mL de solución de glucosa 1M a 20 ml DM). </li><li> Con unas pinzas finas y tijeras de disección, retirar la cubierta exterior y la interior de los ganglios de interés, la exposición de las neuronas. </li><li> Utilizando una pipeta fuego vidrio pulido llena HODM y unido a una microjeringa, aplicar succión suave cerca de la célula de interés (Izquierda dorsal del pedal 1) hasta que la neurona se separa del cerebro y se suspende en la pipeta. </li><li> La pipeta de vidrio se mueve entonces y se sumerge en neurochips individuales cuando la expulsión suave desde la microjeringa permite que las neuronas que se empuja suavemente hacia fuera de la pipeta y se coloca en la parte superior de los agujeros de parches individuales sobre los chips.</li><li> Permitir que las células de sentarse en reposo durante un mínimo de 2 horas a temperatura ambiente para promover su adhesión a la superficie del chip que rodea la abertura. </li></ul> 5. Registros electrofisiológicos Para conectar las fichas para el amplificador (en nuestro caso un amplificador MultiClamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EE.UU.) <ul type="disc"><li> Sustituir la solución en el fluídico subterráneo y en el vial chip con las soluciones de grabación apropiados. En el caso de las neuronas Lymnaea, las cámaras de cultivo superiores están llenos de Lymnaea salina (en mM: NaCl 51,3, 1,7 KCl, 4 CaCl2, y MgCl2 1,5) tamponada a pH 7,9 con HEPES 14. </li><li> Para mayor estabilidad, pegamento el chip en un portaobjetos de vidrio y colocar bajo el microscopio. </li><li> Para conectar el chip al amplificador (en nuestro caso un amplificador MultiClamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EE.UU.), cortar un extremo del tubo e insertar un Silvealambre R que está conectada a la cabeza-etapa. </li><li> Colocar el electrodo de referencia en el vial superior del chip. </li><li> El chip está ahora listo para la grabación. </li><li> Aplicar un paso mV 5 con el amplificador para medir la resistencia total (R t) y determinar la configuración de las neuronas: células adjunta (R t&gt; 1 GΩ); de células enteras (Rt = 50-100 transitorios mW más capacitiva, indicativa de la ruptura de la membrana sobre la abertura), o sin sello (R t &lt;5 MW). En nuestra última serie de experimentos 10, 58% por ciento de las células tenían los sellos de alta resistencia y, de ellos, el 80% de las células excitables mostraron respuestas. </li></ul> 6. Los resultados representativos <ul type="disc"><li> Aplicar despolarizante pulsos de corriente (20 incremento pA) a la neurona (en este caso LPeD1). </li><li> Mantenga la neurona al cierre de Vm a su potencial de reposo (~ - 60 mV). </li><li> Tenga en cuenta las respuestas a estos pulsos despolarizantes. Los potenciales de acción debe rebasamientose observa si la neurona es viable. </li><li> La Figura 4 muestra un resultado representativo que se discute en detalle en 14, 15. </li></ul><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> Figura 4. Las respuestas de tensión (superior) de una neurona a LPeD1 serie graduada de intracelular pulsos de corriente (abajo). Los pulsos de corriente se aplicaron a Vm = - 60mV. Solución de problemas <ul type="disc"><li> Antes de placas, chips de imagen para determinar si la membrana y la apertura son libres de desechos y adecuado para el revestimiento. Nosotros usamos un microscopio vertical y una larga 20x objetivo de distancia de trabajo. En nuestra última serie de experimentos 1, 67% por ciento de los chips se cebaron con éxito de esta manera. </li><li> Si los desechos y / o burbujas de aire están presentes descartan chip y probar con la otra. </li><li> Diversos tratamientos de superficie (plasma) o recubrimientos (PDL, PEI, etc) puede ser juzgado, pero el éxito puede ser altamente dependiente del tipo celularutilizada. </li><li> La composición de la fluídica (&quot;pipeta&quot;) en solución crítica para la formación de la giga-sello y toda la celda. Ajustar la solución, prestando especial atención a la osmolaridad, pH, y el maquillaje iónico. </li><li> Para el cultivo de más largo plazo, empezar con los medios de comunicación en el canal de microfluidos, luego cambiar a la pipeta solución antes de la grabación a través de la gravedad de perfusión suave alimentado (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

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No hay conflictos de interés declarado.

Patch-clamp NRCC la plataforma de la interrogación chip es una herramienta potencialmente poderosa para la alta ensayos de contenido de información farmacéutica y para investigar en modelos in vitro de la enfermedad. Sus ventajas en comparación con pipetas de vidrio son una resistencia acceso bajo, lo cual es una ventaja para sondear células grandes, ya pesar de una capacitancia algo mayor resultará en la dinámica comparables para células más pequeñas. Celular espontánea a los sellos de apertura se han obtenido rutinariamente, y la entrada de células enteras se ha observado que 14 espontánea. Una diferencia clara entre los chips y el método de pipeta de vidrio es el hecho de que la sonda es parte de la placa de cultivo de células y no es manualmente pone en contacto con la membrana celular. El cultivo de células, posiblemente parte de las redes funcionales, los resultados de los modelos más relevantes biológicamente como modelos de enfermedades, y un mecanismo diferente para asegurar la celda de alta para probar los sellos 16. Sin embargo, en contraste con las suspensiones de células, la aspiración Cannot se utiliza para posicionar una celda de la sonda. Neuronas del caracol, como otras células grandes, son susceptibles de posicionamiento manual en la parte superior de la sonda. Para células más pequeñas que requieren largos tiempos de cultivo, hemos obviado la necesidad de cualquier manipulación y mantener una alta probabilidad de obtener un sello por polipéptidos de adhesión de modelado en la parte superior de las sondas para colocar las células en la parte superior de las sondas, y demostró la colocación de las células en el sonda de 17,18. NRCC también está desarrollando una poliimida microfluidos parche-abrazadera chip de 19 con una capacitancia comparable a la del vidrio pipeta. El objetivo final de que es un proyecto múltiples sondas-parche-abrazadera chip que permite el control simultáneo de la actividad electrofisiológica de las neuronas que participan en varias comportamiento de la red en la resolución de los canales iónicos individuales 14. Este método es un método de alta resolución complementaria a las matrices de electrodos múltiples 20.

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

Debido a su exquisita sensibilidad y la capacidad de monitorear y controlar las células individuales en el nivel de los canales iónicos, de patch-clamp es el estándar de oro de la electrofisiología se aplica a modelos de enfermedad y las pantallas de farmacéuticos por igual 1. El método implica tradicionalmente suavemente en contacto una célula con una pipeta de vidrio lleno de una solución fisiológica con el fin de aislar un parche de la membrana bajo su vértice 2. Un electrodo insertado en la pipeta captura de iones canal actividad dentro del parche o membrana, cuando se rompió, por toda la celda. En la última década, patch-clamp virutas se han propuesto como una alternativa 3, 4: una película suspendido separa el medio fisiológico del medio de cultivo, y una abertura en la película microfabricated reemplaza el ápice de la pipeta. Patch-clamp fichas se han integrado en los sistemas automatizados y comercializado para el cribado de alto rendimiento 5. Para incrfacilitar el rendimiento, que incluyen la entrega de fluidos de las células de la suspensión, su posicionamiento en la apertura por medio de succión, y las rutinas automatizadas para la detección de la célula a la sonda juntas y entrar en el modo de célula entera. Nos han informado sobre la fabricación de silicio de un chip de patch-clamp con una impedancia optimizada y forma del orificio que permite la grabación de alta calidad de los potenciales de acción en las neuronas cultivadas de 6 caracoles, recientemente, también han informado de los progresos hacia el interrogatorio neuronas de mamíferos 7. Nuestros patch-clamp chips son fabricados en el Centro Canadiense de Fabricación Fotónica 8, un comercial de la fundición, y están disponibles en grandes series. Estamos ansiosos de participar en la colaboración con los electrofisiólogos para validar el uso de la tecnología NRCC en diferentes modelos. Los chips se utilizan de acuerdo con el esquema general representada en la figura 1: el chip de silicio está en el fondo de un frasco de cultivo de plexiglás y la parte posterior de la abertura está conectado a un subterráneo ChannEl provista de tubos en cada extremo del paquete. Las células se cultivaron en el vial y la célula en la parte superior de la sonda se controla mediante un electrodo de medición insertado en el channel.The dos fuera de los puertos fluídicos facilitar el intercambio de solución con una perturbación mínima a la celda, lo cual es una ventaja en comparación con pipetas de vidrio para intracelular perfusión. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> Figura 1. Principio de medición usando el NRCC parche-abrazadera de chip Detallamos aquí los protocolos de esterilización y preparar las patatas fritas, cargarlos con el medio, a la placa con las células y, finalmente, los utilizan para registros electrofisiológicos.

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Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Mostramos cómo plana patch-clamp fichas fabricadas en el Consejo de Investigación Nacional de Canadá se esterilizan, preparado, cargado con el medio, recubierto de células, y se utiliza para los registros electrofisiológicos.

El cultivo y la electrofisiología de las células en NRCC de patch-clamp chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.6K vistas.  National Research Council of Canada. Mostramos cómo plana patch-clamp fichas fabricadas en el Consejo de Investigación Nacional de Canadá se esterilizan, preparado, cargado con el medio, recubierto de células, y se utiliza para los registros electrofisiológicos.

Video: Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Grabaciones de patch clamp en Inner células del oído pelo Aislado de pez cebra

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Investigación

Neurociencias

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch Clamp grabación de células amacrinas Starburst en un plano de montaje Preparación de Deafferentated retina del ratón

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.