Este método permite la investigación del tejido humano vivo en su estructura 3D natural y composición para la traducción de hallazgos de laboratorio clave en terapias potenciales. Esta técnica permite específicamente la generación de cultivos tisulares a partir de tejido pulmonar humano rese seccionado o explantado quirúrgicamente para la visualización de muestras individuales de tejido pulmonar del paciente fallecido. El tejido pulmonar libre de enfermedades se puede utilizar como cultivos de tejido 3D para modelar enfermedades pulmonares ex vivo, lo que permite el análisis de los pathomecanismos tempranos en una alta resolución espaciotemporal.
Comience colocando la muestra de pulmón resecada en 15 mililitros de medio de cultivo en un plato de cultivo estéril de 15 centímetros y una bandeja metálica estéril cubierta de papel tisú, y llene una jeringa de 30 mililitros con 42 grados Celsius de baja agarosa de punto de fusión. Retire el obturador de un catéter venoso periférico y conecte el catéter a la jeringa de 30 mililitros. Identifique un bronquio de 0,5 a 3 milímetros de diámetro en el tejido de ventilación en una sección intacta del tejido e inserte suavemente la cánula en bronquios en la medida de lo posible.
Utilice fórceps para comprimir la pared del bronquiol alrededor de la cánula, lo ideal para sujetar cualquier arteria pulmonar adyacente al mismo tiempo, para sellar el bronquio alrededor de la cánula y utilizar una abrazadera quirúrgica para ocluir cualquier otra vía respiratoria adicional, para evitar fugas de agarosa. A continuación, utilice los fórceps para levantar el tejido pulmonar de la placa de cultivo, y utilice la jeringa para entregar manualmente la agarosa a través de la cánula, no más rápido que 0,3 mililitros por segundo. Cuando el tejido pulmonar se llena completamente sin sobreinfllar el tejido, retire inmediatamente la cánula y sujete el bronquio.
Sumerja el tejido en un medio de cultivo a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para facilitar la solidificación de la agarosa, y repita el procedimiento de llenado de agarosa para cualquier abertura de bronquiol adicional. Luego, almacene las secciones del tejido pulmonar llenas de agarosa en cuatro grados Celsius medio hasta cortar. Para cortar con precisión el corte pulmonar, identifique las regiones sólidamente llenas de agarosa dentro del tejido pulmonar, que no colapsan cuando se presionan suavemente con pinzas contra la parte inferior de la placa de cultivo celular.
Ex impuestos de 1 a 1,5 centímetros cúbicos de región sólidamente llena con un lado todavía cubierto con pleura, y utilizar pegamento de cianoacrilato para unir el lado plural de cada bloque de tejido al soporte del vibratoma. Cortar todo el camino a través del bloque de tejido largo, hasta que sólo dos a tres milómetros de tejido se dejan sin cortar. Uso de fórceps para transferir cada sección de 500 micrómetros en un pozo de un pozo de doce pocillos que contiene el medio de cultivo, tal como se obtienen.
Cuando todo el tejido haya sido seccionado, transfiera las muestras de cada pozo a platos de cultivo individuales de diez centímetros y coloque un punzante de biopsia de cuatro milímetros a la superficie superior de la rebanada pulmonar cortada con precisión. A continuación, moviendo el punzón en las rotaciones en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj, obtenga punzones tisulares de la muestra pulmonar. Colocar cada punzón en el medio de cultivo celular fresco en pozos individuales de una placa de 96 pozos a medida que se obtienen.
Cuando se hayan obtenido todos los punzones de tejido, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante un máximo de cinco días. El inmunoetiquetado de fibronectina en núcleos celulares utilizando inmunofluorescencia en cultivos de tejido pulmonar 3D humano permite la toma de imágenes de la estructura alveolar preservada ex vivo. El tratamiento de los punzones de corte pulmonar cortados con precisión humana con un cóctel de citoquinas profibrotica durante 48 horas da como resultado cambios similares a la fibrosis en los cultivos de tejido 3D de pulmón humano, incluyendo la inducción significativa de los componentes relevantes de la matriz extracelular de fibrosis, colágeno tipo uno, y genes de fibronectina.
Además, los niveles proteicos de la vimentina marcador mesenquimal están regulados en tres de cada cuatro pacientes después del tratamiento de los punzones de cultivo de tejido pulmonar 3D. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de ARN por PCR cuantitativo en tiempo real, o el análisis de proteínas por hinchazón occidental, para evaluar la expresión de genes y proteínas respectivamente dentro del tejido. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para las investigaciones en el campo de la neumología experimental, para explantar la biología pulmonar, así como para realizar estudios toxicológicos y farmacológicos en muestras de tejido humano.
Recuerde que el tejido humano vivo es potencialmente infeccioso y que siempre se deben tomar medidas de precaución como el uso de equipos de protección personal y el almacenamiento adecuado de tejidos, transporte y manipulación de residuos durante la realización de este procedimiento
