Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las enzimas fosfotransferencia, incluida la especificidad del sustrato enzimático y la cinética de reacción. La principal ventaja de esta técnica es que permite una rápida recopilación de múltiples conjuntos de datos que son muy consistentes, lo que permite una cuantificación estadísticamente robusta de la actividad enzimática. La demostración visual de este método es fundamental porque detectar las reacciones en las placas TLC y cuantificar las especies radiactivas en las reacciones es mucho más fácil de demostrar que explicar.
Además de Astha, demostrar el procedimiento será Asia Poudel, otro estudiante graduado de mi laboratorio. Comience este protocolo con sobreexpresión inducible de una proteína etiquetada con histidina como se describe en el protocolo de texto. Preparar un mililitro de resina de ácido nitriloacético de níquel en una columna de gravedad para purificar la proteína.
El día antes de su uso, equilibre la columna durante la noche a cuatro grados centígrados con dos mililitros de tampón de equilibrio. Al día siguiente lleve la columna de cuatro grados centígrados a temperatura ambiente antes de cargar el lysate clarificado y déjela reposar durante aproximadamente dos o tres horas. A continuación, resuspender el pellet en el búfer de lelisis.
Sonicar las células sobre hielo durante intervalos de 10 veces 10 segundos, pausando 30 segundos entre pulsos. Aclare el lesato por centrifugación a 3.080 veces g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados utilizando una microcentrífuga. Prepare el lysate clarificado con volúmenes iguales de búfer de lelisis, luego aplique el lysate preparado y aclarado a la columna y recoja el flujo a través.
Vuelva a aplicar el flujo de sombreado clarificado a través de la columna y recoja el flujo secundario a través. A continuación, lave la columna con cinco mililitros de tampón de lavado uno y recoja el flujo a través. Lave la columna de nuevo con cinco mililitros de tampón de lavado dos y recoja el flujo a través.
Ahora aplique dos mililitros de búfer de elución. Recoja el flujo a través en dos fracciones de un mililitro cada una. Durante la purificación de proteínas, la inclusión de cloruro de magnesio en los tampones de purificación, una modificación del protocolo del fabricante, es esencial para la actividad enzimática.
Para evaluar cualitativamente la purificación de proteínas mediante SDS-PAGE, ejecute 20 alícuotas de microlitros de todas las fracciones de columna en un apilamiento del 4%, un 10% de gel de poliacrilamida durante 60 minutos a 170 voltios. Mancha el gel con 0.1%Coomassie azul a temperatura ambiente durante cinco horas, balanceándose suavemente en una balancín de sobremesa. A continuación, detenga el gel en 40%metanol-10%ácido acético glacial durante la noche a temperatura ambiente, balanceándose en el balancín de sobremesa.
Dialyze la fracción eluida dos contra el tampón de diálisis en una proporción de 200:1 usando un dispositivo de diálisis de un mililitro con un corte de peso molecular de 20 kilodalton durante la noche a cuatro grados centígrados. Determinar la concentración de la muestra de proteína dializada midiendo la absorbancia a 280 nanómetros y utilizando el coeficiente de extinción molar calculado. Almacene las alícuotas de 100 microlitros de la muestra de proteína dializada a menos 80 grados centígrados hasta su uso.
Antes de realizar la reacción, prepare las placas de cromatografía de capa fina de celulosa PEI lavándolas en agua desionizada. Coloque las placas en una cámara de vidrio con agua de doble destilación a una profundidad de aproximadamente 0,5 centímetros. Después de permitir que el agua migre a la parte superior de la placa, saque las placas de la cámara de vidrio y déjelas en un estante de sobremesa para secar durante la noche.
Marque las placas secas a dos centímetros de un borde con un lápiz suave para indicar dónde se aplicarán las muestras para TLC. Para muestras de dos microlitros, aplique muestras de no menos de un centímetro de distancia. Al planificar experimentos, deje siempre un punto en cada placa sin usar para servir como carril en blanco para la cuantificación de muestras.
Para realizar el ensayo de actividad enzimática, prepare reacciones individuales utilizando gamma P32 ATP como se describe en el protocolo de texto. Añadir la RSH después de que los otros componentes se hayan mezclado, ya que la adición de RSH a la mezcla que contiene nucleótidos inicia el ensayo de actividad enzimática. Para controlar la hidrólisis ATP a partir de la contaminación de la actividad de la nucleasa, ensamble una reacción de 10 microlitrotros que no contenga proteína e incubarla en paralelo.
Detectar muestras de dos microlitros en T igual a cero y al final del experimento para asegurar que el ATP no se hidrolizó en ausencia de proteína. Inmediatamente después de la adición de RSH, retire dos microlitros y úbralo en la placa de celulosa PEI etiquetada como la T es igual a la muestra de cero minutos. Incubar la reacción a 37 grados centígrados, eliminando las alícuotas de dos microlitros en los puntos de tiempo deseados.
Después de que se hayan recogido todas las alícuotas, realice cromatografía de capa fina llenando la cámara de cromatografía con fosfato de potasio monobásico de 1,5 molares a una profundidad de 0,5 centímetros. Sumerja el borde inferior de la placa en disolvente y permita que el disolvente migre a la parte superior de la placa durante aproximadamente 90 minutos. Retire la placa del tanque de cromatografía y colóquela en un tendedero de sobremesa para secar al aire durante la noche.
Después de que la placa esté seca, envuelva la placa en película plástica para evitar la transferencia de material radiactivo al casete de imágenes y analizarla por autoradiografía. Exponga la placa de celulosa PEI que contiene reacciones separadas a un cassette de fósforoimagen durante cuatro horas a temperatura ambiente. Después de la exposición, imagine el cassette en un fósforoimager.
Usando software de imágenes con una interfaz gráfica de usuario, dibuje regiones de interés o ROI seleccionando primero Dibujar un Rectángulo, luego use el ratón para dibujar ROI rectangulares alrededor de un carril entero y los puntos ATP y guanosina-tetrafosfato contenidos dentro de ese carril. Utilice los comandos Seleccionar, Copiar y Pegar para dibujar ROI idénticos dentro de los otros carriles para asegurarse de que los ROI miden la señal dentro de áreas idénticas en cada carril. Incluya ROI de un carril no utilizado para ser utilizado como espacios en blanco.
Usando los comandos Analizar, Herramientas, Administrador de ROI, Agregar comandos del software de imágenes, seleccione todos los ROI dibujados en la placa de peicelulosa. Ahora utilice los comandos Analizar, Establecer mediciones, Medir para cuantificar la intensidad de la señal dentro de cada ROI y exportar las mediciones como spreadsheeet. En la hoja de cálculo, reste los valores de ROI en blanco de las señales experimentales.
La conversión de los datos al porcentaje de guanosina-tetrafosfato sintetizado es fundamental, ya que garantiza que los conjuntos de datos recopilados en diferentes días con diferentes lotes de proteínas o diferentes gamma P32 ATP sean consistentes y se puedan agrupar para el rigor estadístico. Esta caricatura demuestra cómo se utilizan las regiones de interés para definir un carril que contiene la señal radiactiva total en una muestra y las regiones de interés de ATP radiactiva y tetrafosfato de guanosina componentes. Las señales de tetrafosfato de ATP y guanosina se normalizan a la señal total en lugar de informar de los valores absolutos porque el error de pipeteo o la descomposición del sustrato radiactivo pueden afectar la señal total en la muestra, pero no afectan la actividad enzimática.
Aquí se muestra una placa TLC real de una reacción realizada utilizando C.difficile RSH purificado. Una reacción de control que no contiene proteínas permite cuantificar la hidrólisis ATP no capturada, mientras que un carril en blanco permite una cuantificación precisa de la señal. En las manchas de ATP y guanosina-tetrafosfato, la enzima transfiere el fosfato radiactivo del sustrato de ATP al precursor del PIB, creando tetrafosfato de guanosina radiactivo.
Esto confirma que la tetrafosfato de guanosina putativa sintetasa de C.difficile es una enzima activa. Mediante el muestreo de la reacción a intervalos, se puede observar el progreso. Aquí se observa la señal sin procesar en cada punto de tiempo.
ATP está disminuyendo y el tetrafosfato de guanosina está aumentando. Aquí se muestran los datos normalizados. Las barras de error son mucho más pequeñas porque la normalización explica cualquier error de pipeteo.
Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado de no rayar la resina en la placa TLC, ya que esto puede interferir con la migración de disolventes. Esta es una técnica muy accesible con un análisis de datos sencillo que puede proporcionar rápidamente una cuantificación robusta de la actividad enzimática. Lo hemos utilizado para confirmar que Clostridium difficile sintetiza tetrafosfato de guanosina, que nunca se ha reportado previamente.
No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso y debe seguir las reglas de su institución para el almacenamiento y uso de materiales radiactivos mientras realiza este procedimiento. Este método puede proporcionar información sobre la síntesis de tetrafosfato de guanosina, pero también se puede aplicar a otras reacciones de fosfotransferencia, incluyendo la actividad de la proteína quinasa y la síntesis de diguanylato cíclico.
