La investigación fue apoyada con el Desarrollo Profesional y Fondos de Investigación de inicio de la Universidad de Ontario Institute of Technology (UOIT) al Dr. John A. Samis y los Institutos Canadienses de Salud Salud Premio de Investigación Profesional de Investigación de Estudiantes de Irina Levit. Los autores reconocen Shannon Everett (La enseñanza y el Centro de Aprendizaje, UOIT) por su ayuda preparando el video. Los autores reconocen el Dr. Michael E. Nesheim (Departamento de Bioquímica de la Universidad de Queen, Kingston, ON) para su tutoría, perspicacia y útiles debates. Los autores también reconocen Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hemostasia y Trombosis Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, Reino Unido) para la prestación de los plasmas de pacientes DIC utilizados en el estudio.

1. Preparación de plasma deficiente en FV Humano <ol><li> Este método es una modificación del procedimiento descrito originalmente por Bloom et al 4. </li><li> Obtenga la sangre humana de un voluntario adulto que consiente saludable (Hombre o Mujer, Edad 18 - 50 años) que no está tomando ningún medicamento. Use guantes de látex y una bata de laboratorio durante todo el procedimiento. </li><li> Preparar 100 ml de 3,2% (w / v) de citrato trisódico en agua destilada. Cargar 6,0 ml de esta solución en 60 ml jeringas separadas. Eliminar el aire por el émbolo deprimente cuidadosamente hasta la marca de 6,0 ml en la jeringa. </li><li> Utilice un algodón con alcohol para limpiar el área de la vena cubital entre bíceps y el antebrazo. Conectar aparato mariposa de calibre 20 a una jeringa de 3 ml. Introduzca la aguja en la vena cubital mariposa y extraer suavemente el émbolo hasta que la sangre se llena hasta la marca de 3 ml. Deseche la jeringa con sangre. Este paso se realiza para eliminar cualquier factor tisular liberado del endotelio dañado en la agujalesión sitio que pueden activar el proceso de coagulación e interferir con la preparación de plasma deficiente en FV. </li><li> Conecte aguja mariposa &#39;cargada&#39; con jeringa de 60 ml de citrato trisódico 6,0 ml y extraer suavemente el émbolo hasta que la sangre llegue a la marca de 60 ml en la jeringa. (10,9 mm La concentración final de citrato). </li><li> Retire la jeringa de la aguja de mariposa y mezclar suavemente la jeringa, manteniendo un dedo enguantado o el pulgar en la salida de la jeringa. </li><li> Continuar la extracción de sangre en 60 ml jeringas cada una con 6,0 ml de 3,2% de citrato trisódico como se ha descrito anteriormente. Uno debe anticipar la recuperación de aproximadamente 50% del volumen de sangre citratada como plasma después de la centrifugación y que 50 l de plasma deficiente en FV se requiere por muestra en el ensayo en microplaca. Nuestro laboratorio de rutina procesa 300-420 ml de sangre citratada a la vez con 5-7 x 60 ml jeringas cada uno con 6,0 ml de 3,2% de citrato trisódico / jeringa. Esto es suficiente FV plasma deficiente para aproximadamente 3.000 microlos ensayos de placa (ver más abajo). </li><li> Retire la aguja del brazo de mariposa voluntario y presione una gasa estéril sobre el sitio de punción de la vena durante 1,0 min. Cubra el sitio de la punción venosa con una venda estéril. </li><li> Centrifugar la sangre citratada a 3.300 xg durante 20 min a temperatura ambiente. Recuperar capa superior de plasma de color amarillo a un vaso de precipitados de plástico con una barra de agitación con una pipeta de transferencia de plástico teniendo cuidado de no perturbar la capa inferior de células de sangre roja y blanca. </li><li> Medir el volumen de plasma en ml y retener 100 l de plasma antes de la adición de EDTA en hielo durante el tiempo futuro coágulo de protrombina (PT) prueba (ver abajo). </li><li> Agregar lentamente sólido EDTA al plasma citratado con agitación suave a temperatura ambiente para lograr 5 mM (concentración final). Una vez que el EDTA se ha disuelto, ajustar el pH a 7,0 mediante la adición gota a gota de NaOH 1,0 M con agitación suave. </li><li> Cubra vaso con Saran Wrap y se incuba durante 8-10 h sin agitación a 37 º C. </li><li> Cada hora 2, se recuperan 100 l deel plasma tratado con EDTA en hielo y determinar la PT en el momento de la incubación con EDTA y comparar con el PT de plasma antes de la adición de EDTA (ver arriba). </li><li> Para las determinaciones del PT, 8 tiras removibles lugar immunomodule bien entrado sujeción del molde de plástico e insertar en un lector de microplacas. </li><li> Orient tiras immunomodule en un lector de microplacas como: vacío, la muestra vacía, vacía, vacía de la muestra, vacío, vacío y de izquierda a derecha en el soporte de plantilla para minimizar la interferencia dispersión de la luz de la vecina que contienen muestras tiras. Asimismo, el uso sólo pozos 2-7 de arriba a abajo en cada tira 8 immunomodule bien para minimizar la interferencia de dispersión de luz de los bordes de soporte de plantilla de plástico. </li><li> El ensayo de microplaca FV es capaz de medir la formación del coágulo de fibrina en al menos 12 muestras diferentes de forma simultánea (6 muestras por cada tira de immunomodule más de 2 tiras immunomodule). </li><li> Usando una pipeta multicanal, añadir 50 l de HBS (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) acada pocillo de microplaca para cada uno de muestra a ensayar. Usando una pipeta única, añadir 50 l de una mezcla de plasma humano normal de referencia (NHP) o plasma antes de la adición de EDTA o en diversos tiempos de incubación después de la adición de EDTA para separar pocillos de la microplaca. </li><li> Usando una pipeta multicanal, añadir 50 l de tromboplastina (Véase más abajo para método de preparación) a todos los pocillos de la microplaca con plasma a ensayar. Incubar en un lector de microplacas a 25 º C durante 1 min y el programa de lector de microplacas a agitar la placa durante el sec 15-25 min de incubación de la 1. </li><li> Utilizando el ordenador interconectado con el lector de microplacas, acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas. Ajuste el lector de absorbancia, a 405 nm de longitud de onda, de modo a temperatura cinética, a 25 ° C, y el programa de lector de microplacas a agitar durante 5 segundos, y leer la absorbancia a 405 nm cada 5 s durante 6 min. </li><li> Usando una pipeta multicanal, se añade cloruro de calcio (50 l de 25 mM en agua destilada; 2.1mm finaconcentración l) a todos los pocillos de microplaca, espere 15 segundos y pulse la tecla &quot;Inicio&quot; icono en el menú de microplacas SoftMax Pro para comenzar el ensayo. </li><li> Determinar el PTS de los perfiles de absorbancia frente a tiempo en SoftMax Pro como el tiempo para alcanzar el máximo aumento medio en la absorbancia a 405 nm (El punto medio de la absorbancia frente a la curva sigmoidal tiempo producido después de tromboplastina y la adición de cloruro de calcio. Véase más adelante, Figura 1). </li><li> Cálculo de la FV 1-etapa de actividad de la sesión el tiempo de coagulación (seg) vs actividad del registro de FV (unidades / ml) como se ilustra a continuación en la Figura 2A. Para los propósitos de cuantificación, 1Unidad de actividad FV se define como la actividad presente en 1,0 ml NHP antes de la activación intencional con añadió trombina (Ver más adelante, los análisis de muestras de plasma humano con la FV 1-etapa y 2-etapa microplaca de ensayo de coagulación). </li><li> Preparar 4.0l de HEPES 20 mM que contiene NaCl 0,15 M en agua destilada con agitación suave. Ajustar el pH a 7,4 con dropw lentoise adición de NaOH 5,0 M (HBS, pH 7,4). </li><li> Obtener una longitud suficiente de tubos de diálisis y enjuague a fondo con agua destilada. Un nudo en un extremo de la tubería. Transferencia de plasma tratado con EDTA a tubos de diálisis con una pipeta de transferencia de plástico, retirar el aire, y ate un nudo en el otro extremo de la tubería. </li><li> Con cuidado, colgar el plasma tratado con EDTA en la tubería en la HBS con agitación suave. Cubrir con Saran Wrap y se dializa para 14-16h con agitación suave a 4 ° C. </li><li> Retire con cuidado el plasma EDTA-treated/dialyzed en 3,0 ml alícuotas de 15,0 ml tubos de tapón de rosca y retener 100 l para el ensayo de PT &#39;final&#39; FV plasma deficiente en hielo. Almacenar el plasma deficiente en FV-a -80 ° C hasta su uso. En las condiciones descritas anteriormente, el aumento PTS de 10-15 seg antes de la adición de EDTA a 90-100 sec 8-10 h después de la adición de EDTA. El plasma deficiente en FV preparada por este método habitualmente contiene menos de 0,1% de la sustancia activa presente en el FV de partidaplasma humano fresco. </li></ol> 2. Preparación de tromboplastina <ol><li> La diálisis es necesaria para eliminar cualquier calcio de este reactivo para permitir precisamente temporización formación del coágulo de fibrina desde el momento de la adición de cloruro de calcio para iniciar el proceso de coagulación. </li><li> Preparar 100 ml y 4.0L de HEPES 20 mM y NaCl 0,15 M en agua destilada en un vaso de precipitados de plástico con agitación suave. Ajustar el pH a 7,4 con la adición lenta gota a gota de NaOH 5,0 M (HBS, pH 7,4). </li><li> Añadir 6,0 ml de HBS, pH 7,4 a cada vial de reactivo de tromboplastina, coloque la tapa y agite suavemente hasta disolver. Incubar reactivo en viales tapados durante 15 minutos a temperatura ambiente para disolver el material se secó. Agitar suavemente hasta disolver completamente. </li><li> Cortar una longitud suficiente de tubos de diálisis, enjuague bien con agua destilada, y ata un extremo de la tubería con un nudo. Transferir a un tubo de diálisis de tromboplastina, eliminar el aire, y ata el otro extremo de la tubería con un nudo. </li><li> Californiarefully colgar tubo de diálisis en 4.0L de HBS, pH 7,4 y se agita suavemente cubierto con Saran Wrap a 4 º C durante 14-16 h. </li><li> Transferir 3,0 ml de alícuotas de la tromboplastina dializada a tubos de 15 ml de tapón roscado y se almacena a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 3. Preparación de 1-FV etapa de microplacas ensayos de coagulación curvas de actividad estándar <ol><li> Descongelar plasma deficiente en FV, NHP, y tromboplastina a 37 ° C durante 10 min. Mezclar suavemente FV plasma deficiente y tromboplastina de forma independiente, para separar transferir cubetas de lavado de plástico, y se incuba en hielo. Guarde el NHP en hielo después mezclando suavemente. Tienda cloruro de calcio (25 mM en agua destilada) en una bandeja de lavado separado a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 200 l cada uno de 2-veces diluciones seriadas de NHP de 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-veces en HBS, pH 7,4 usando 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Vortex pocillo e incubar en hielo. </li><li> Coloque las tiras removibles 8 immunomodule así en psoporte de plantilla lastic e insertar en un lector de microplacas. </li><li> Orient tiras immunomodule en un lector de microplacas como: vacío, la muestra vacía, vacía, vacía de la muestra, vacío, vacío y de izquierda a derecha en el soporte de plantilla para minimizar la interferencia dispersión de la luz de la vecina que contienen muestras tiras. Asimismo, el uso sólo pozos 2-7 de arriba a abajo en cada tira 8 immunomodule bien para minimizar la interferencia de dispersión de luz de los bordes de soporte de plantilla de plástico. </li><li> El ensayo de microplaca FV es capaz de medir la formación del coágulo de fibrina en al menos 12 muestras diferentes de forma simultánea (6 muestras por cada tira de immunomodule más de 2 tiras immunomodule). </li><li> Encienda el lector de microplacas y acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas. </li><li> Usando una pipeta multicanal, hacer adiciones simultáneas de plasma deficiente en FV (50 l) a todos los pocillos de la microplaca de muestra. Utilizar una pipeta única, añadir 50 l de las diluciones en serie de 10 NHP preparados anteriormente para separar pocillos de la microplaca.</li><li> Usando una pipeta multicanal, añadir tromboplastina (50 l) a todos los pocillos de la muestra. Incubar en el lector de microplacas a 25 º C durante 1 min y el programa de lector de microplacas a agitar la placa durante el sec 15-25 min de incubación de la 1. </li><li> Utilizando el ordenador interconectado con el lector de microplacas, acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas. Ajuste el lector de absorbancia, a 405 nm de longitud de onda, de modo a temperatura cinética, a 25 ° C, y el programa de lector de microplacas a agitar durante los primeros 5 segundos después de la adición de cloruro de calcio, y la absorbancia medida a 405 nm cada 5 s durante 6 min a partir de entonces. El intervalo de 5 segundos agitación no se incluye en los tiempos de coagulación calculado (ver a continuación). </li><li> Con una pipeta multicanal, añada cloruro de calcio (50 l de 25 mM en agua destilada, concentración final 3,5 mM) a todos los pocillos de la microplaca muestra, espere 15 segundos, pulse el botón &quot;Inicio&quot; icono de la aplicación en microplaca SoftMax Pro desde el ordenador para comenzar la ensayo. </li><li> Ttiempos de coagulación que se calcula como el tiempo en segundos para alcanzar el punto medio entre el mínimo y el máximo de absorbancia a 405 nm después de tromboplastina y la adición de cloruro de calcio. </li><li> Las velocidades iniciales de la formación del coágulo se calculan como la tasa de aumento de la absorbancia a 405 nm (mUnidades / min) que abarca el primero 5 puntos de tiempo de formación de coágulos en la porción lineal de la curva de absorbancia frente a tiempo. </li><li> La extensión de la formación del coágulo se calculó como la diferencia entre la absorbancia máxima y mínima a 405 nm (unidades) alcanzada durante el evento de formación de coágulos. </li></ol> 4. Análisis de muestras de plasma humano con la FV 1-etapa y dos etapas de ensayo de microplacas Coagulación <ol><li> Descongelar plasma deficiente en FV, NHP, plasmas de muestra, y de tromboplastina a 37 ° C durante 10 min. Mezclar suavemente FV plasma deficiente y tromboplastina independientemente, transferir para separar plástico cubetas de lavado de ELISA, e incubar en hielo. Guarde los plasmas PHN y la muestra en hielodespués mezclando suavemente. Tienda cloruro de calcio (25 mM en agua destilada) en una bandeja de lavado separado de ELISA a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 200 l cada una de 40-veces diluciones de plasmas NHP y muestra en HBS, pH 7,4 utilizando 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Vortex pocillo e incubar en hielo. </li><li> Inserte 8 tiras removibles immunomodule así en el soporte de plástico plantilla e insertar en un lector de microplacas. </li><li> Suplente vacío, vacío, muestra, vacío, muestra vacía, vacía, vacía y tiras immunomodule de izquierda a derecha en el soporte de plantilla para minimizar la interferencia dispersión de la luz de la vecina que contienen muestras tiras. Usar sólo los pozos 2-7 de arriba a abajo en cada tira immunomodule para minimizar las interferencias de dispersión de luz de los bordes de soporte de plantilla de plástico. </li><li> Encienda el lector de microplacas y acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas. </li><li> Usando una pipeta multicanal, añadir plasma deficiente en FV (50 l) a todos los pocillos de la microplaca de muestra. El uso de un single pipeta, añadir 50 l de 40-veces NHP diluida o plasmas muestra preparada anteriormente para separar pocillos de la microplaca. </li><li> Usando una pipeta multicanal, añadir tromboplastina (50 l) a todos los pocillos de la muestra. Incubar en el lector de microplacas a 25 º C durante 1 min y el programa de lector de microplacas a agitar la placa durante el sec 15-25 min de incubación de la 1. </li><li> Utilizando el ordenador interconectado con el lector de microplacas, acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas. Ajuste el lector de absorbancia, a 405 nm de longitud de onda, de modo a temperatura cinética, a 25 ° C, y el programa de lector de microplacas a agitar durante los primeros 5 segundos después de la adición de cloruro de calcio, y la absorbancia medida a 405 nm cada 5 s durante 6 min a partir de entonces. El intervalo de 5 segundos agitación no se incluye en los tiempos de coagulación calculado (ver a continuación). </li><li> Usando una pipeta multicanal, se añade cloruro de calcio (50 l de 25 mM en agua destilada; concentración final 6,25 mm) para todas las muestras pocillos de la microplaca y pr inmediatamenteSEE &quot;Inicio&quot; icono de la aplicación en microplaca SoftMax Pro de la computadora para comenzar el ensayo. </li><li> Al final de la carrera, determinar el tiempo, la velocidad inicial, y el alcance de la formación de coágulos de 40-veces NHP diluido y plasmas de muestra a partir de los perfiles de absorbancia frente al tiempo en SoftMax Pro. </li><li> Teniendo en cuenta la dilución 40-veces, usar el tiempo de coagulación para cada muestra para calcular la actividad de FV en Unidades / ml de la FV 1-etapa curva de actividad estándar de tiempo de registro Clot vs actividad del registro de FV (figura 2A). Esto representa la actividad FV-1 etapa o que sin &#39;intencional&#39; activación por la trombina. </li><li> Desde FV está activado con trombina para el cofactor activo, FVa 1, un segundo ensayo después de la adición y la incubación con trombina es crítica para medir con precisión la FV 2-etapa de actividad de una muestra de plasma (con &#39;intencional&#39; activación por trombina añadido). </li><li> Para la FV de 2 etapas de ensayo, preparar 200-300 l de trombina purificada a 18t 100 nM en HBS, pH 7,4 y se incuba en hielo. Planee el uso de 10 l de trombina diluida para cada muestra de plasma a ensayar con la FV 2-etapa de ensayo. </li><li> Diluir 120 l de la NHP arriba y plasmas de muestra de 40-veces a 100-veces con 170 l de HBS, pH 7,4 que contiene 2,8 mM de cloruro de calcio. Añadir 10 l de trombina (10 nM concentración final) a cada muestra. Vortex bien para mezclar e incubar a 37 ° C durante 1 min. </li><li> Diluir NHP y plasmas de muestra con 500-veces mediante la adición de 400 l de HBS, pH 7,4, así vórtice, y el ensayo de 50 l de cada muestra de plasma en la FV 1-etapa microplaca de ensayo como se describe anteriormente. </li><li> Determinar el tiempo de coagulación para NHP y cada muestra de plasma ensayadas a partir de los perfiles de absorbancia frente a tiempo en SoftMax Pro. Teniendo en cuenta la dilución de 500 veces, usar el tiempo de coagulación para cada muestra para calcular la FV 2-etapa de actividad de la FV 1-etapa estándar curva de tiempo de registro Clot vs actividad del registro de FV (figura 2A). </li><li> El total de actividades FVty entonces se puede calcular como FV 2-etapa de actividad - FV 1-etapa de actividad. </li></ol>

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	<li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factor+V+activation+paradox.">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li><li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa.">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li><li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V.">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li><li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma.">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis.">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation.">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li><li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency.">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li><li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol.">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li><li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays.">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li><li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates.">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li><li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies.">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li><li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+coagulation+assays.">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li><li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microplate+coagulation+assay+for+Factor+V+in+human+plasma.">Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma.</a> Thromb. J. 9, 11-16 (2011).</li><li>Toh, C. H., Downey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+Testing+in+disseminated+intravascular+coagulation.">Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation.</a> Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).</li><li>Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation:+Findings+in+346+patients.">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li><li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets.">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li><li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+prothrombinase+complex.">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li><li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+TAFI,+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor.">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li><li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation+(DIC).">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li><li>Dahlb&#228;ck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+thrombophilia+due+to+a+previously+unrecognized+mechanism+characterized+by+poor+anticoagulant+response+to+activated+protein+C:+prediction+of+a+cofactor+to+activated+protein+C.">Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C.</a> PNAS. 90, 1004-108 (1993).</li><li>Dahlb&#228;ck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+pathogenic+mechanisms+of+thrombophilic+disorders.">Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders.</a> Blood. 112, 19-27 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de ensayo cinético de microplacas describe el desarrollo de una novela, técnica rápida, barata y conveniente para la medición de la actividad de coagulación FV en muestras de plasma humano que no tienen (FV 1-etapa de ensayo) o se han activado intencionadamente con agregado de trombina (FV 2-etapa de ensayo). El ensayo utiliza un lector de microplacas cinético y todos los materiales y los reactivos necesarios están disponibles comercialmente o pueden ser hechos en casa. El ensayo monitoriza continuamente el cambio en la dispersión de luz de plasma durante la formación del coágulo de fibrina a 405 nm. La microplaca de ensayo tiene la ventaja de usar pequeños volúmenes de muestra de plasma (l) y es susceptible de análisis de múltiples muestras simultáneamente (hasta 12). Estos atributos de ensayo son ventajosos cuando un equipo caro y reactivos se utilizan (analizadores automatizados y los plasmas deficientes en Factor-); sólo pequeños volúmenes de muestra están disponibles (plasmas de pacientes) o el análisis de un gran número de muestras (f Durante purificación FVrom plasma). El ensayo de microplaca FV tiene la ventaja añadida de que es conveniente, rápido, y no requiere el aislamiento y purificación de los componentes constituyentes requeridos. En comparación con el manual de inclinación de tubo 3, 4 y automatizados 5-7 ensayos de FV que se ha informado, el ensayo de microplaca FV tiene rango comparable útil de tiempos de coagulación (25-75 seg) y los correspondientes niveles de FV en la muestra (0,5 hasta 0.005 Unidades / ml), y la sensibilidad / límites de detección (20-80pM). En comparación con los manuales del tubo de inclinación ensayos de FV que sufren de una evaluación subjetiva visual de la formación de coágulos 3, 4, el ensayo de microplaca FV permite la medición objetiva y cuantitativa de la tiempo de coagulación, del tipo inicial, y el alcance de la formación del coágulo de fibrina. En comparación con los ensayos automatizados FV que sufren de la exigencia de costosos analizadores y reactivos 5.7, los reactivos FV microplaca de ensayo y los materiales son baratos y todos los materiales necesarios pueden ser purchased comercialmente o hecho en casa. Manual de inclinación de tubo 3, 4 y automatizados 5-7 ensayos FV generalmente sólo proporcionan el tiempo de formación del coágulo; no el tiempo, del tipo inicial, y el alcance de la formación de coágulos de fibrina que son todos exactamente medido espectrofotométricamente con el ensayo de microplaca de FV. Por último, los ensayos 5-7 inclinación manual del tubo 3,4 y automatizado FV sufren de sólo ser capaz de medir la actividad de FV en muestras de plasma de uno en uno, mientras que el ensayo de microplaca de FV es susceptible de alto rendimiento y 12 muestras pueden ser analizaron simultáneamente. La microplaca de ensayo se usó para demostrar que la FV en 9 plasmas de pacientes con CID fue menos activa que en NHP debido a una combinación de tiempos de coagulación retardada y menores tasas iniciales de la formación de coágulos en la FV 1-etapa ensayo. Las velocidades iniciales de la formación de coágulos en la FV 2-etapa de ensayo en los plasmas de pacientes con CID no se cambiaron de NHP. Las extensiones de la formación de coágulos en la patien DICt plasmas no fueron también cambió de NHP en la FV 1-etapa y ensayos de 2 etapas. Disminución de la FV de 1 etapa, 2 etapas y las actividades totales puede haber sido debido a un aumento del consumo FV 19 y / o inactivación 6 de acuerdo con otros estudios en la patogénesis de este trastorno de la sangre adquirida. Dada la extensión de la formación de coágulos en los plasmas DIC era el mismo como se observa con NHP, esta variable fue más probablemente el resultado de la concentración de fibrinógeno en el plasma deficiente en FV y no relacionada con las características de los plasmas de pacientes. Los resultados de la microplaca de ensayo indica que la medición de la actividad de FV en muestras de plasma humano se puede obtener a partir de la tasa de tiempo inicial y de la formación de coágulos de la FV 1-etapa de ensayo y el tiempo de formación del coágulo y la actividad total de la FV 2 - etapa de ensayo. No fue posible obtener una medición cuantitativa de la actividad de FV en una muestra de plasma sobre la base de la extensión de la formación de coágulos en tél FV 1 - 2 y ensayos de etapa o la velocidad inicial de formación de coágulos en la FV 2-etapa de ensayo. Teniendo en cuenta todas las reacciones alcanzado aproximadamente el mismo grado de formación de coágulos de 0,35 a 0,45 unidades entre la absorbancia inicial antes y después de la absorbancia máxima de tromboplastina y la adición de cloruro de calcio, la medición de la extensión de la formación del coágulo no proporciona una evaluación cuantitativa de la actividad de FV en un dado muestra de plasma. La microplaca de ensayo novedoso encontrarán uso en la investigación y clínico para la medición de la actividad de FV en muestras de plasma humano y fracciones durante su purificación a partir de plasma humano y animal. La microplaca de ensayo puede utilizarse para medir el tiempo, del tipo inicial, y el alcance de la formación de coágulos; parámetros generalmente no monitorizar simultáneamente en manuales tubo de inclinación ensayos y analizadores automatizados de coagulación. Esta información proporciona más de una evaluación cuantitativa completa de la participación de FV durante el evento de formación de coágulosen el plasma humano que ha sido previamente reportado 3-7. Esta información es especialmente importante en la investigación y en laboratorios clínicos en la medición de cambios significativos en la actividad FV en muestras de plasma o purificado con FV o FVa. El ensayo de microplaca de FV también se puede usar para caracterizar y medir compuestos que pueden activar o inactivar FV y FVa, medir la actividad de FV en pacientes con riesgo de trombosis venosa, como resultado de la mutación FV Leiden 20, 21 y para controlar la actividad de FV durante su purificación a partir de plasma. El ensayo de microplaca FV es fácilmente adaptable para medir la actividad de cualquier factor de coagulación en la vía extrínseca, intrínseca, o común utilizando el apropiado factor de plasma deficiente y reactivos para iniciar la formación de fibrina. El ensayo aumentará nuestra comprensión de la bioquímica FV a través de una medición más exacta y completa de su actividad en la investigación y los laboratorios clínicos. Finalmente, esta información tendrá un impacto positivo entornos sanitarios a través de un diagnóstico precoz y el desarrollo de tratamientos más eficaces para las personas que padecen trastornos de la coagulación, como el CID.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (Opcional) </td></tr><tr><td> Kinetic lector de microplacas </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectra Max 190 </td><td> SOFTmax PRO 4.3 LS software </td></tr><tr><td> Una mezcla de plasma normal humano de referencia </td><td> Precisión Productos Biológicos </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Citrato trisódico </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-deficiente plasma humano 4 </td><td></td><td></td><td> A partir de plasma humano fresco y almacenado en alícuotas a -70 ° C. </td></tr><tr><td> 3 y 60ml jeringas </td><td> Becton Dickenson </td><td> 309585 y 136898 </td><td></td></tr><tr><td> Butterfly aparato </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> Calibre 20 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescador </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Tromboplastina </td><td> Trinity Biotech </td><td> T1106 </td><td> Dializada frente a HBS, pH 7,4 y se almacenó en alícuotas a -70 ° C. </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> La trombina humana 15 </td><td></td><td></td><td> De plasma humano; almacenaron a -20 ° C en 50% (v / v) de glicerol. </td></tr><tr><td> Membrana de diálisis </td><td> Pescador </td><td> 21-152-6 </td><td> 6 8kDa corte de peso molecular; 50mm x 3m. </td></tr><tr><td> Plantilla extraíble y soporte de tiras de 8 pocillos. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63 y 469957 </td><td></td></tr><tr><td> ELISA bandejas de lavado </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml de microfuga y 15 tubos de tornillo ml tapados. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 y 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta multicanal </td><td> Pescador </td><td> 2703630 </td><td> 8 canales modelo. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

En respuesta a una lesión, la coagulación sanguínea se activa y da como resultado la generación de la proteasa de la coagulación, la trombina. La trombina escinde el fibrinógeno en fibrina, que forma un coágulo insoluble que detiene la hemorragia. Factor V (FV) en su forma activada, FVa, es un cofactor esencial para la proteasa FXa y acelerador de la generación de trombina durante la formación del coágulo de fibrina como parte de protrombinasa 1, 2. Manual de ensayos de FV se han descrito 3, 4, pero consumen mucho tiempo y subjetivo. Automatizados ensayos de FV se han reportado 5-7, pero el analizador y los reactivos son caros y generalmente proporcionan sólo el tiempo de coagulación no, la velocidad y extensión de la formación de fibrina. La plataforma microplaca se prefiere para medir catalizadas por enzimas eventos por conveniencia, tiempo, coste, de pequeño volumen, la supervisión continua, y de alto rendimiento de 8, 9. Ensayos de microplacas han sido reportados para la lisis del coágulo 10, la agregación plaquetaria11, 12 y factores de coagulación, pero no para la actividad de FV en el plasma humano. El objetivo del método era el de desarrollar una microplaca de ensayo que mide la actividad FV durante la formación de fibrina en el plasma humano. Este método de microplaca novela describe un ensayo simple, barata y rápida de la actividad FV en el plasma humano. El ensayo utiliza un lector de microplacas cinético para controlar el cambio de absorbancia a 405 nm durante la formación de fibrina en el plasma humano (Figura 1) 13. El ensayo mide de forma precisa el tiempo, la frecuencia inicial, y la extensión de la formación del coágulo de fibrina. Se requiere sólo cantidades mu l de plasma, se completa en 6 min, tiene alto rendimiento, es sensible a la 24-80pM FV, y mide la cantidad de involuntariamente activado (1-etapa de actividad) y la trombina activada por FV (Actividad 2-etapa ) para obtener una evaluación completa de su actividad funcional total (2-etapa de actividad - 1-etapa de actividad). Intravascular diseminadacular diseminada (CID) es una coagulopatía adquirida que más a menudo se desarrolla a partir de infecciones preexistentes 14. DIC se asocia con un mal pronóstico y la mortalidad aumenta por encima de la patología preexistente 15. El ensayo se utilizó para demostrar que en 9 pacientes con coagulación intravascular diseminada, la FV 1-etapa, etapa 2, y las actividades totales se redujeron, en promedio, un 54%, 44%, y 42%, respectivamente, en comparación con humano normal agrupado plasma de referencia (NHP). El ensayo de microplaca FV es fácilmente adaptable para medir la actividad de cualquier factor de coagulación. Este ensayo aumentará nuestra comprensión de la bioquímica FV a través de una medición más exacta y completa de su actividad en la investigación y la práctica clínica. Esta información tendrá un impacto positivo entornos sanitarios a través de un diagnóstico precoz y el desarrollo de tratamientos más eficaces para los trastornos de la coagulación, como el CID.

Resultados representativos FV - Preparación de 1-etapa microplaca ensayos de coagulación curvas patrón de actividad Un ejemplo representativo de la formación del coágulo de fibrina en el ensayo de FV en el tiempo generada por el lector de microplacas se ilustra en la figura 1. El ensayo de FV mide con precisión el tiempo, del tipo inicial, y el alcance de la formación del coágulo de fibrina. La inspección de los pozos sobre la terminación ensayo confirmó que se produjo la formación de coágulos. Todas las reacciones alcanzado aproximadamente el mismo grado de formación de coágulo con un cambio general en la absorbancia a 405 nm de 0,35 - 0,45 unidades entre la absorbancia de partida antes y después de la absorbancia máxima de tromboplastina y la adición de cloruro de calcio. Ejemplos representativos de FV 1-etapa de actividad normales curvas de tiempo de registro Clot (en segundos) vs actividad de registro FV (unidades / ml) y log velocidad inicial de formación de coágulos (en mUnidades / min) vs actividad de registro FV (Unidades / ml ) para diluciones en serie de NHP se muestra en la <strong&gt; Figura 2A y la Figura 2B, respectivamente. Colocación del gráfico doble logarítmico de tiempo de coagulación vs FV 1-Actividad indicando una fuerte correlación entre estas variables tras el análisis de regresión lineal (Figura 2A, R 2 = 0,980). Colocación del gráfico doble logarítmico de la velocidad inicial de formación de coágulos vs Actividad FV también se indica una fuerte relación entre estas variables tras el análisis de regresión lineal (Figura 2B, R 2 = 0,983). La relación de ambos el tiempo de coagulación de registro y la velocidad inicial de formación de coágulos vs Activity Log FV se mantuvo lineal para NHP se diluye hasta 512 veces. Desde FV circula en NHP en aproximadamente 40 nM 12-16, la microplaca de ensayo es sensible a unos 24-FV 80pM en NHP. Dado que la constante de la interacción de FVa-FXa-lípido en protrombinasa disociación es de aproximadamente 1 nM 17, el ensayo de microplaca de FV es completamente adecuado para la medición de los niveles de FV en el fisiológicamente relevant rango nM para la función de FVa en protrombinasa. Usando el ensayo de FV microplaca, también se determinó que el rango normal de la actividad de FV en el ensayo de actividad FV 1-etapa de 15 plasmas de control sanos (Masculino y Femenino, Edad 18-20yrs) fue (media ± desviación estándar, rango): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Esto concuerda bien con la actividad normal sano FV y la gama (0.66-1.14U/ml) informó por Cutler et al. para la FV 1-etapa de actividad determinado con un analizador automático 7. La variabilidad intra-ensayo del tiempo, alcance y velocidad inicial de formación de coágulos en la FV 1-fase de ensayo en 6 pozos en 8 diferentes días fue del 3,4%, 4,4% y 3,1%, respectivamente. La variabilidad inter-ensayo del tiempo, la extensión y velocidad inicial de formación de coágulos en la FV 1-etapa ensayo en 6 pocillos de 8 experimentos diferentes en 8 días diferentes fue 7,1%, 7,8%, y 9,2%, respectivamente. Por lo tanto, la variabilidad intra-e inter-ensayo de estas tres medivariables de rojo estaba a un nivel bajo y aceptable para el rendimiento del ensayo robusto dentro y entre microplaca de ensayo de muestras múltiples simultáneamente (hasta 12). Resultados representativos - Ensayo de muestras de plasma humano con la FV 1-etapa y dos etapas microplaca de ensayo de coagulación La curva estándar de Clot registro del tiempo vs actividad del registro de FV (figura 2A) se utilizó para medir la actividad de FV en NHP y 9 plasmas de pacientes con CID que no fueron activados intencionalmente con adición de trombina (FV 1-etapa de actividad) o se activaron con intencionalmente añadió trombina (FV 2-etapa de actividad) y los resultados se muestran en la Tabla 1. Todos los plasmas 9 DIC paciente exhibió FV 1-etapa actividades y las tasas iniciales de la formación del coágulo que se disminuyeron en promedio, un 54% y 18%, respectivamente, de NHP. La extensión de la formación de coágulos en la FV 1-fase de ensayo en los pacientes con DIC no fueron muy diferentes de PHN, y aumentó, en promedio, en un 13% a partir de NHP. <html> La activación de trombina generada NHP con un aproximado de 8-veces mayor en FV 2-etapa de actividad por encima de la FV 1-etapa de actividad (Tabla 1). Esto indica que la FV en el PHN estaba presente principalmente en su forma inactivada y está de acuerdo con los resultados reportados previamente utilizando manuales tubo de inclinación ensayos FV 3, 4 y ensayos automatizados FV 5-7. El FV 2-etapa y actividad total también disminuyó en los pacientes con CID, en promedio, un 44% y 42%, respectivamente, de NHP. Las tasas iniciales y grados de formación de coágulos en la FV 2-etapa de ensayo en los pacientes con CID no fueron significativamente diferentes de NHP, y varía en promedio, en aproximadamente 9% y 4%, respectivamente, de la observada con NHP. Estos resultados indican que, en comparación con la FV en NHP, la FV en los plasmas de pacientes con CID resultó en un tiempo prolongado y disminución de la frecuencia de la formación del coágulo de fibrina y que el paciente FV fue, en promedio, sólo el 56% como activable con trombina también. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La formación de coágulos en plasma normal combinado de referencia humano, medido con la cinética de microplacas FV 1-etapa de ensayo de coagulación. Formación del coágulo de fibrina en NHP se controló continuamente a 405 nm utilizando un lector de microplacas cinético. La trama es la salida del lector de microplacas de una reacción de 6 min de 32-veces NHP diluida, plasma deficiente en FV, tromboplastina, y cloruro de calcio en un pocillo de microplaca. El eje vertical representa el cambio en la absorbancia a 405 nm que se produjeron como resultado de la formación de fibrina en plasma. El tiempo de formación de fibrina se definió como el tiempo para alcanzar el máximo aumento medio en la absorbancia o el punto medio de la curva (36.40 segundos). La velocidad inicial de formación del coágulo se define como la tasa de cambio de absorbancia a 405 nm en los puntos de tiempo primero 5 del incremento lineal de la porción de absorbancia de la curva (611,88 mUnidades / min). El extienda de campaña de la formación del coágulo se definió como la diferencia entre la absorbancia máxima y mínima a 405 nm (0,35 unidades). <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Las curvas de calibración de tiempo y velocidad inicial de formación de coágulos frente a la actividad normal de Factor V en una mezcla de plasma de referencia humana utilizando la FV 1-etapa microplaca de ensayo. NHP se diluyó en serie (0 - a 512-veces en HBS) y se ensayó con la FV 1-etapa microplaca de ensayo como se describe en el protocolo. Log-log parcelas de la hora y la velocidad inicial de formación de coágulos frente a la actividad en la FV FV 1-etapa microplaca de ensayo se muestran después de un modelo de regresión lineal de los datos en los paneles A y B, respectivamente. <table border="1"><tbody><tr><td> Muestra </td><td> 1-etapa de ensayo de actividad (Unidades / ml) </td><td> 1-fase de ensayo Extensión (unidades) </td><td&gt; 1-etapa de ensayo de tasa inicial (mUnidades / min) </td><td> 2-etapa de ensayo de actividad (Unidades / ml) </td><td> 2-etapa de ensayo de Extensión (unidades) </td><td> 2-etapa de ensayo inicial Tipo (mUnidades / min) </td><td> La actividad total (unidades / ml) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1,02 </td><td> 0,363 </td><td> 744,96 </td><td> 7,93 </td><td> 0,433 </td><td> 375,84 </td><td> 6,91 </td></tr><tr><td> Paciente 1 </td><td> 0,36 </td><td> 0,404 </td><td> 583,80 </td><td> 3,84 </td><td> 0,432 </td><td> 249,96 </td><td> 3,48 </td></tr><tr><td> Paciente 2 </td><td> 0,67 </td><td> 0,416 </td><td> 704,04 </td><td> 5,28 </td><td> 0,469 </td><td> 323,16 </td><td> 4,61 </td></tr><tr><td><strong&gt; Paciente 3 </td><td> 0,31 </td><td> 0,435 </td><td> 562,08 </td><td> 3,92 </td><td> 0,453 </td><td> 294,96 </td><td> 3,61 </td></tr><tr><td> Paciente 4 </td><td> 0,39 </td><td> 0,435 </td><td> 617,04 </td><td> 4,14 </td><td> 0,462 </td><td> 372,60 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> Paciente 5 </td><td> 0,73 </td><td> 0,401 </td><td> 641,40 </td><td> 5,91 </td><td> 0,433 </td><td> 354,24 </td><td> 5,18 </td></tr><tr><td> Paciente 6 </td><td> 0,45 </td><td> 0,403 </td><td> 600,72 </td><td> 4,16 </td><td> 0,445 </td><td> 393,96 </td><td> 3,71 </td></tr><tr><td> Paciente 7 </td><td> 0,49 </td><td> 0,395 </td><td> 575,40 </td><td> 4,89 </td><td> 0,449 </td><td> 357,48 </td><td> 4,40 </td></tr><tr><td> Paciente 8 </td><td> 0,19 </td><td> 0,448 </td><td> 489,00 </td><td> 2,89 </td><td> 0,450 </td><td> 330,48 </td><td> 2,70 </td></tr><tr><td> Paciente 9 </td><td> 0,64 </td><td> 0,423 </td><td> 699,48 </td><td> 5,11 </td><td> 0,455 </td><td> 417,24 </td><td> 4,47 </td></tr></tbody></table> Tabla 1 Actividad de FV en NHP y en 9 pacientes que desarrollaron la coagulación intravascular diseminada (DIC). El FV 1-etapa, etapa 2, y la actividad total en el NHP y 9 plasmas de pacientes con CID se determinaron a partir de la FV 1-etapa microplaca de ensayo estándar curva de tiempo de formación del coágulo frente a la actividad FV (figura 2A) y se dan en unidades / ml. Las tasas iniciales (velocidad de aumento de la A405nm más de cinco primeros puntos de tiempo en mUnidades / min) y de las extensiones (A405nm máxima - mínima A405 nm) de formación de coágulos en la FV 1 - y 2-etapa microplaca de ensayo también se muestran.

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Este estudio describe un ensayo en microplaca novela que mide la actividad FV coagulación durante la formación del coágulo de fibrina en el plasma humano que no se ha informado anteriormente. El método utiliza un lector de microplacas cinético para medir continuamente el cambio en la absorbancia a 405 nm durante la formación del coágulo de fibrina en plasma humano.

Medición de actividad de factor V en el plasma humano usando un ensayo de coagulación de microplacas

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

measurement-factor-v-activity-human-plasma-using-microplate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.8K vistas.  University of Ontario Institute of Technology. Este estudio describe un ensayo en microplaca novela que mide la actividad FV coagulación durante la formación del coágulo de fibrina en el plasma humano que no se ha informado anteriormente. El método utiliza un lector de microplacas cinético para medir continuamente el cambio en la absorbancia a 405 nm durante la formación del coágulo de fibrina en plasma humano.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación en los cromosomas mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Un método rápido para el procesamiento de sangre para aumentar el rendimiento de los niveles plasmáticos de péptido en la sangre humana

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...