Este método puede ayudar con la investigación de proteínas de membrana como transportadores y canales. La información sobre la pérdida de la tasa de rotación del sustrato comparando la actividad y especificidad de las proteínas y las diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que minimiza la variación de desplazamiento potencial y las condiciones de amortiguación libre de cloruro.
Y aumenta significativamente la precisión de la determinación de la tasa de rotación debido a mediciones más exactas del potencial de membrana. Reúne los elementos para los escalones del puño. Estos incluyen dos puntas de pipeta micro-capilares, una hoja afilada y una pinza deslizante.
Para el electrodo tienen alambre de plata, papel de arena y una solución de cloruro de potasio molar a mano. Además tienen etanol y agua para la limpieza y una fuente de alimentación de CC. Continúe trabajando con las dos puntas de microtubo.
Comience con la sugerencia que contendrá el búfer. Coloque la segunda punta junto a la primera. Mueva la segunda punta, por lo que cuando se inserta su parte estrecha se extenderá al menos cinco milímetros en la parte estrecha de la primera.
Marque la posición donde se adjuntará el primer búfer que contiene la punta. A continuación, utilice la pinza para medir la longitud del electrodo del puente de sal de microagar. Utilice la cuchilla para cortar la punta a la longitud adecuada.
Limpie la superficie cortada con etanol seguido de agua. A continuación, obtenga una longitud de aproximadamente ocho centímetros de alambre de plata para el electrodo. Limpie el cable de las toallitas con etanol seguido de agua.
Después de la limpieza, utilice papel de arena para suavizar la superficie en un centímetro de longitud en un extremo. Este cable con su extremo alisado está listo para ser recubierto electroquímicamente. Coloque el extremo suavizado en la solución de cloruro de potasio con el otro extremo conectado a una fuente de alimentación de CC para el recubrimiento.
Cuando esté recubierto, desconecte el electrodo y límpielo con agua. Después de secarlo, determinar la longitud que le permite penetrar la punta micro capilar lo más profundamente posible. Corte el electrodo del lado sin recubrimiento a la longitud adecuada.
Ahora, pasen a preparar una solución salina con agarosa. En un matraz que contenga agua disolver el cloruro de potasio y utilizar un agitador magnético para ayudar a la mezcla. Después de retirar el agitador añadir agarosa al matraz.
Lleve el matraz a un microondas y caliente para derretir la agarosa a unos 100 grados centígrados. Sáquelo para comprobar visualmente que la agarosa se disuelve por completo. Una vez que la agarosa se disuelve la pipeta 10 microlitros en el micro-capilar lentamente para evitar burbujas de aire.
Es importante pipetear cuidadosamente la solución de sal de agar en la punta micro capilar, especialmente a altas concentraciones de agar. Si no se hace correctamente, las burbujas de aire se producen fácilmente en la punta y bloquean el flujo eléctrico. Después de retirar la punta de la pipeta empuje el electrodo en ella.
Asegúrese de que el electrodo penetre en la solución salina. Cuando el electrodo está a temperatura ambiente, conéctelo a un electrodo de referencia en un amplificador. Apoyar el electrodo de referencia para que pueda ser bajado en un recipiente de plástico con un mililitro de tampón.
A continuación, sumerja el electrodo del puente de sal en la solución. Aplique una tensión y compruebe que hay una respuesta de corriente antes de continuar. Si la prueba es correcta, desconecte los electrodos.
Si es necesario, almacene el electrodo del puente de sal sumergiéndolo en una solución de cloruro de potasio molar. A continuación, prepare el tampón que contiene la punta de plástico. Tome una punta micro capilar e identifique un punto a dos centímetros de la parte estrecha.
Utilice un cable de calentamiento para doblar el tubo 90 grados en esta posición. Con un cuchillo afilado cortar el tubo a cinco milímetros de la doblada. Limpie el área cortada con etanol seguido de agua.
Antes de continuar, utilice un microscopio de luz con una escala para medir el diámetro del agujero en la punta. A continuación, mueva la pipeta para que esté cerca de un recipiente de disolvente y otro de tampón. Pipetear tres microlitros del disolvente dentro y fuera de la punta.
A continuación, llene la punta de medición con tres microlitros de tampón. Ahora, recupere el puente de sal de la solución de cloruro de potasio. Enchufe la punta de medición con el tampón en el electrodo del puente de sal.
Conecte el electrodo del puente de sal y el electrodo de referencia a un amplificador. En este punto, suspenda el electrodo del puente de sal en la solución tampón con el electrodo de referencia. Una representación de la configuración para el experimento está en este esquema.
Durante el experimento, la membrana se formará al final del tampón que contiene la pipeta. Recopile datos para encontrar la capacidad de la membrana. Para ello, aplique una señal de tensión alterna triangular para crear una respuesta de corriente alterna rectangular.
A continuación, busque la conductividad y el voltaje a corriente cero. Automatice la aplicación de una rampa de tensión que va de menos 50 a 50 milivoltios y registre la corriente. Ajuste una función lineal a los datos.
La pendiente es la conductividad, la intercepción x es la tensión a corriente cero. Cuando haya terminado, retire la punta de medición del puente de sal. Llene una nueva punta de medición con tampón, ajústela a un valor de pH diferente para configurar un gradiente de protones a través de la membrana.
Restablecer la configuración experimental con la nueva punta de medición y electrodos con el fin de repetir las mediciones. Aquí están las grabaciones representativas de voltaje de corriente en presencia de un gradiente de pH. Y, en ausencia de un gradiente de pH.
Las líneas representan un ajuste lineal a los datos. La ecuación Nernst predice el desplazamiento en el punto de intersección del eje X para los diferentes valores de pH. Estos datos representan el cambio en el potencial de membrana a tiempo para un electrodo de cloruro de plata estándar en blanco, y el electrodo de puente de sal de microagar en negro.
El electrodo del puente de sal de agar era más estable con un desplazamiento máximo de menos de cinco milivoltios durante 300 segundos de medición. En esta gráfica del posible cambio en función del gradiente de pH se considera que los dos electrodos se comportan de manera significativamente diferente a medida que aumenta el gradiente de pH. La tasa de rotación de protones se puede encontrar y comparar para los dos tipos de electrodos.
Aquí están los números de rotación de protones determinados para la proteína de desacoplamiento mitocondrial un UCP1 medido por el electrodo de puente de sal en comparación con un electrodo estándar. También hay datos para UCP3 preparado de forma similar. Las tasas parecen más precisas con el electrodo del puente de sal de agar.
Al intentar este procedimiento es importante recordar asegurarse de que el electrodo penetra en la solución de sal de agar. El puente de sal también debe sumergirse en la solución tampón. Por último, asegúrese de que la solución de sal de agar no contenga burbujas de aire.
