Este protocolo describe la caracterización y aplicación de una nueva sonda lipídica fluorescente sensible al pH, específica para membranas celulares, que permite a los investigadores monitorizar la exo y la endocitosis en células vivas. La mayoría de los informes anteriores sobre la proteína de membrana se basan en la proteína de fluorescencia verde sensible al pH, que es indirecta. Como mimético lipídico, el ND6 se integra en la membrana celular y, por lo tanto, informa fielmente sobre el tráfico de membranas lipídicas.
La sonda ND6 se vuelve fluorescente solo si se incrusta en el entorno de la membrana biológica. La intensidad de fluorescencia de esa sonda se correlaciona con la protonación y desprotonación del grupo principal de piperazina. Por lo tanto, emite una fluorescencia mucho más fuerte a un pH más bajo.
La exocitosis y la endocitosis son procesos ubicuos que subyacen a la secreción y absorción de muchas moléculas de señalización. Por lo tanto, ND6 se puede utilizar para estudiar algunas cuestiones fundamentales en biología celular y ciencias biomédicas. Haley, Oliver y Jonathan, estudiantes de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento.
Comience preparando una cámara de imágenes que permita el control de la temperatura y la salida de entrada de la solución para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas. Configure un dispositivo programable para cambiar las soluciones de perfusión y administrar el estímulo eléctrico en puntos de tiempo definidos durante la obtención de imágenes. Pesa una cantidad adecuada de ND6.
Disolverlo en dimetilsulfóxido y dejar que se solubilice a temperatura ambiente. A continuación, sonique la solución brevemente. Filtre la solución madre cruda con un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar los agregados de colorante grandes.
Usando un espectrofotómetro convencional o de micro volúmenes, determine la concentración de colorante a 405 nanómetros. Antes de la aplicación, diluya la solución madre a una concentración de un miligramo por mililitro utilizando la solución de baño. Mantenga la solución madre a temperatura ambiente en la oscuridad.
Agregue la solución madre de ND6 al medio de cultivo a la concentración final de un microgramo por microlitro e incorpórela para etiquetar de forma ubicua los compartimentos de membrana endocitosados, como los endosomas. Para reducir la extensión del marcaje de las vesículas sinápticas, suprimir la actividad neuronal espontánea farmacológicamente. Después de etiquetar selectivamente las vesículas sinápticas como se describe en el manuscrito, monte el cubreobjetos que contiene las células en la cámara de imágenes.
Conecte el sensor de temperatura, la entrada de perfusión y la punta de vacío a la cámara de imágenes. Ajustar la velocidad de perfusión a aproximadamente 0,2 mililitros por segundo e iniciar la perfusión de la solución de tyrode normal precalentada que contiene NBQX y DAP5 para eliminar el exceso de ND6 en el cultivo. Ajuste el enfoque y localice el campo de visión apropiado que contenga neuronas sanas y bien distribuidas que lleven neuritas conectadas.
Evitar las áreas que contienen dicoloides no resueltos. Intente obtener imágenes de células cargadas de ND6 con diferentes tiempos de exposición para identificar la mejor configuración de imágenes. Establezca el protocolo de estimulación y perfusión, el intervalo de fotogramas y la duración total utilizando la información del manuscrito de texto.
Iniciar la adquisición de imágenes acompañado de estimulación y perfusión sincronizadas. Monitorizar la estimulación y el intercambio de soluciones durante la toma de imágenes. Detenga la perfusión después de que terminen las imágenes.
Retire el cubreobjetos y limpie la cámara de imágenes para el próximo ensayo. Haga una copia de seguridad y haga una copia electrónica de todos los archivos de imagen. Seleccione y abra el programa de análisis para la extracción de datos.
Abra o importe una pila de imágenes en el programa de análisis. Después de generar una máscara binaria, utilice la función de análisis de partículas con el tamaño de área y la circularidad adecuados para solicitar regiones de interés, o ROI, correspondientes a membranas celulares, endosomas, lisosomas o botones sinápticos. Seleccione cuatro ROI de fondo en regiones sin celdas dentro del campo de visión.
A continuación, guarde todos los ROI seleccionados. Alinee todos los fotogramas dentro de las pilas de imágenes de lapso de tiempo ND6. Establezca la primera imagen como referencia y alinee el resto con ella mediante un registro rígido, lo que mitigará los artefactos debidos a la deriva XY.
A continuación, guarde las pilas de imágenes alineadas. Aplique los ROI guardados a pilas de imágenes ND6 alineadas. Mida las intensidades medias de píxeles de la fluorescencia ND6 para cada ROI en cada fotograma de la pila de imágenes.
A continuación, exporte los resultados para su análisis estadístico. Calcule la intensidad media de los ROI de fondo para obtener el ruido de referencia, que se restará de todos los ROI seleccionados. Promedie las tres intensidades medias más altas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de la solución de tyrode pH 5.5 para obtener la intensidad de fluorescencia máxima, definida como 100% para la normalización.
Promedie las tres intensidades medias más bajas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de cloruro de amonio de 50 milimolares para establecer la intensidad de fluorescencia mínima, definida como 0% para la normalización. Calcule los cambios de fluorescencia relativos para cada ROI en función de sus propias intensidades de 0% y 100%. Derive los cambios medios de fluorescencia, la cinética de los cambios y otros valores o gráficos a partir de datos individuales de ROI.
Los puntos fluorescentes de color verde brillante a lo largo de los procesos neuronales fueron visibles después de cargar las células neuronales con ND6. Una fuerte correlación entre las intensidades de fluorescencia de ND6 y FM464 también sugirió la tinción de vesículas sinápticas por ND6. Se observó una disminución en la fluorescencia de ND6 en respuesta tanto a la estimulación eléctrica como a la estimulación con alto contenido de potasio, lo que sugiere que ND6 reside en la membrana de la vesícula sináptica y que la luz de la vesícula sináptica se neutraliza durante la liberación.
Bajo una estimulación eléctrica exhaustiva, el tratamiento con M beta CD redujo significativamente la liberación y recuperación de vesículas sinápticas medida por imágenes ND, lo que sugirió que el colesterol de membrana facilita la exocitosis y endocitosis de las vesículas sinápticas. Baf A1 impidió la recuperación de la fluorescencia de ND6 después de la estimulación al bloquear de forma aguda la reacidificación de las vesículas sinápticas recuperadas. Es imprescindible tener conocimientos básicos de microscopía de fluorescencia.
Es muy importante una planificación cuidadosa de las condiciones fisiológicas para respaldar la obtención de imágenes de células vivas. Es crucial determinar con precisión la concentración de la solución madre de ND. Si es posible, vuelva a medir la concentración de la solución madre antes de cada uso.
Manténgalo alejado de la luz solar directa para evitar el blanqueamiento fotográfico y la descomposición de la sonda.
