Este método, CARIC, puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la post-transcripción de la recreación genética proporcionando un censo completo de proteínas de unión al ARN. La principal ventaja de CARIC es su capacidad para capturar proteínas unidas a varios tipos de ARN como los ARN y los ARN no codificantes. Este método se puede utilizar en varios tipos y el organismo para estudiar la interacción de la proteína de ARN en el trabajo.
En primer lugar, el cultivo de células de HeLa en DMEM suplementado a 37 grados Celsius en una atmósfera de cinco por ciento de CO2. Cuando las células alcanzan alrededor del 80 por ciento de confluencia, reemplace el medio de cultivo en cada plato con 15 mililitros de medio precalentado y fresco. Añadir 15 microlitros de 100 mililitros de la UE a cada plato a una concentración final de un milimolar.
Para muestras experimentales y sin control UV añadir 7,5 microlitros de 100 mililitros cuatro SU a cada plato. Cubrir los platos con papel de aluminio y cultivar las células durante 16 horas utilizando las condiciones anteriores. Después de esto, añadir la mitad de la cantidad anterior de la UE y/o cuatro SU a las placas apropiadas y continuar cultivando durante otras dos horas.
Para comenzar la reticulación in vivo, retire el medio de cultivo y lave cada plato tres veces con PBS usando cinco mililitros de PBS por lavado. Retire el PBS residual tanto como sea posible. Para las muestras experimentales y no cuatro de control SU, coloque los platos sobre hielo con la tapa quitada.
Utilice un enlace transversal UV para irradiar las células con luz UV a 365 nanómetros y a dos jules por centímetro cuadrado. Para las muestras de control SIN UV, coloque los platos sobre hielo y protéjalos de la luz. A continuación, agregue un mililitro de tampón de prelisis a cada plato.
Utilice un elevador de células de goma para raspar las células y recoger la suspensión de prelisis en un tubo de 15 mililitros. Añadir tampón de prelisis a un tubo que contenga la suspensión de dos platos ajustando el volumen total a seis mililitros. A continuación, agregue un volumen igual de búfer de lysis R.
Pase el lito celular a través de una jeringa con una aguja estrecha varias veces hasta que el izado sea claro y homogéneo. Incubar el izado a cuatro grados centígrados con rotación suave durante una hora. Después de esto diluir el analia en 20 volúmenes de tampón de dilución y dividirlo en fracciones de 15 mililitros en tubos de notrafiltración de 15 mililitros, corte molecular de 10 kilodaltones.
Con un rotador de cucharón oscilante, gire los tubos a 4000 veces G y cuatro grados celsius durante unos 15 minutos hasta que cada fracción se concentre en un volumen inferior a un mililitro. Añadir 14 mililitros de tampón de dilución a cada fracción de izado concentrado y repetir el proceso de concentración. A continuación, combine las fracciones y concentrelas en un volumen de seis mililitros utilizando el proceso de concentración descrito anteriormente.
En primer lugar, prepare la mezcla de reacciones como se describe en el protocolo de texto. Agregue esta mezcla de reacción a los seis mililitros de licate pre-despejado y mezcle bien. Añadir 162,5 microlitros de reactivo reductor y mezclar bien.
Incubar a temperatura ambiente en un agitador orbital a 800 rpm durante dos horas. Después de esto apagar la reacción añadiendo cinco mililitros EDTA e incubando en el agitador orbital a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, divida la mezcla de reacción entre dos tubos de 50 mililitros, cada uno de los que contiene cuatro volúmenes de metanol preenfriado e incubar a 30 grados centígrados negativos durante 30 minutos.
Centrifugar a 4000 veces G y cuatro grados celsius durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y agregue entre uno y dos mililitros de metanol preenfriado al pellet. Pipet arriba y abajo para romper el pellet asegurándose de que el pellet termina completamente suspendido sin trozos visibles.
Repita dos veces el proceso de centrifugación y resuspensión. Después de esto, saque cuidadosamente el metanol residual tanto como sea posible asegurándose de no molestar el pellet. Añadir 10 mililitros de tampón de reconstitución y pipetear hacia arriba y hacia abajo para disolver el pellet.
Centrifugar a 4000 veces G y cuatro grados celsius durante 10 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo asegurándose de recoger 20 microlitros de la muestra para el control de calidad. Transfiera la muestra limpia y reconstituida a las cuentas de agarosa de estreptavidina preparadas.
Incubar a cuatro grados centígrados con rotación suave durante la noche. Gire hacia abajo las cuentas a 4000 veces G durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo asegurándose de recoger 20 microlitros de la muestra para el control de calidad.
Lavar las perlas con 10 mililitros de tampón de lavado A.Incubar con rotación suave a 12 rpm y a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, gire hacia abajo las cuentas a 4000 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y repita el proceso de lavado y centrifugación una vez más.
Repita este proceso de lavado para el búfer de lavado B y el búfer de lavado C como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, lavar las cuentas con 10 mililitros de clorhidrato de Tris de 50 milimolares. Gire las cuentas hacia abajo a 4000 veces G durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y divida las perlas uniformemente entre dos tubos de microcentrífuga 1.5. Para comenzar a eludir los RNP capturados, agregue 400 microlitros de tampón de elución de biotina preparada a 400 microlitros de cuentas lavadas y asentadas. Incubar en un agitador orbital a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Luego incubar en un agitador orbital con un bloque de calor a 1500 rpm y 65 grados Celsius durante 10 minutos. Centrifugar las perlas a 7800 veces G durante un minuto y recoger el RNP eludido. Añadir 400 microlitros de tampón de elución de biotina fresca a las cuentas.
Repita el proceso de incubación y centrifugación para recoger un segundo elute y combinar los dos eluidos en un solo tubo de 15 mililitros. A continuación, añada tres volúmenes de búfer de dilución a los eluts RNP combinados para disminuir la concentración de SDS. Usando un tubo de ultrafiltración de 0,5 mililitros, concentre la muestra en aproximadamente 40 microlitros como se describe en el protocolo de texto.
Añadir 0,5 microgramos por microlitros RNase A e incubar a 37 grados Centígrados durante dos horas para liberar los RBP de la RNase reticulada. Recoger dos microlitros de RBP para el control de calidad. Al optimizar los protocolos CARIC, los pasos de control de calidad son críticos.
El control de calidad representativo de las muestras etiquetadas con clic se realiza mediante análisis de fluorescencia en gel. Sólo la muestra doblemente etiquetada muestra una banda de frotis fuerte en el alto peso molecular que representa la señal de RNP reticulados. La señal RNP se suprime omitiendo las cuatro SU o la UE. También puede ser abolido por la digestión con RNase A.In algunos casos se observa una banda fuerte desprestigié en la muestra de control no cuatro SU.
Esta banda representa la RNase sin cruzar etiquetada que se degradará durante la inaturación por calor en la mayoría de los casos. El control de calidad de la deficiencia de la encuesta de afinidad se evalúa a través del análisis de manchas occidentales que muestra las señales de biotina en las muestras antes de la extracción y después de la extracción. Un análisis de tinción de plata de los PBP capturados revela que para las células de HeLa, la eficiencia de captura total general está entre 0.05 y 0.1 por ciento de las proteínas de entrada.
Al intentar este procedimiento es importante recordar que las ARNases son sensibles a las ribonucleasas. Mantenga el entorno experimental lo más limpio posible para reducir la desgredación de RNase. Después de este procedimiento, la identificación de almake de proteínas mediante espectrometría de masas se puede preformar para revelar las proteínas que unen el hierro.
Después de su desarrollo, la técnica CARIC allanará el camino para una comprensión más completa de la transcripción postal de la regulación OT en el trabajo.
