이 방법, CARIC, RNA 결합 단백질의 포괄적인 인구 조사를 제공 하 여 유전자 레크리에이션의 후 전사의 분야에서 주요 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다. CARIC의 주요 장점은 mRNA 및 비코딩 RNA와 같은 다양한 종류의 RNA에 바인딩된 단백질을 포착하는 능력입니다. 이 방법은 다양한 유형 및 유기체에서 작용시 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있다.
첫째, 5%의 CO2 대기에서 섭씨 37도에서 DMEM을 보충한 배양 헬라 세포. 세포가 약 80%에 도달하면 각 접시의 배양 배지를 예동, 신선한 배지의 15 밀리리터로 대체합니다. 각 접시에 100 밀리머 EU의 15 마이크로리터를 추가하여 1 밀리머의 최종 농도를 유지합니다.
실험용 및 자외선 제어 샘플의 경우 각 접시에 100 밀리머 4 SU의 7.5 마이크로리터를 추가합니다. 이전 조건을 사용하여 16 시간 동안 세포를 호일로 덮고 요리를 덮습니다. 그 후, EU 및/또는 4개의 SU의 이전 금액의 절반을 적절한 판에 추가하고 2시간 동안 계속 배양합니다.
생체 내 교차 연결에서 시작하려면, 배양 매체를 제거하고 세척 당 PBS의 5 밀리리터를 사용하여 PBS로 각 접시를 세 번 세척하십시오. 잔여 PBS를 가능한 한 많이 제거합니다. 실험적이고 4개의 SU 제어 샘플이 없는 경우 뚜껑을 제거한 채 접시를 얼음 위에 놓습니다.
UV 크로스 링커를 사용하여 365 나노미터의 UV 빛과 2개의 줄의 제곱을 통해 세포를 조사합니다. 자외선 제어 샘플이 없는 경우, 얼음 위에 접시를 놓고 빛으로부터 보호하십시오. 다음으로 각 접시에 프리리시스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.
고무 셀 리프터를 사용하여 세포를 긁어 내고 15 밀리리터 튜브에서 프리 리시즈 서스펜션을 수집합니다. 총 볼륨을 6밀리리터로 조정하는 두 접시의 서스펜션이 포함된 튜브에 프리리시스 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 동일한 양의 R 리시스 버퍼를 추가합니다.
리스가 명확하고 균일 할 때까지 좁은 바늘로 주사기를 통해 셀 리스를 여러 번 전달합니다. 1 시간 동안 부드러운 회전과 섭씨 4도에서 lysate을 배양. 이 후 희석 버퍼의 20 볼륨에서 lysate를 희석하고 15 밀리리터 여과 튜브, 10 킬로달톤의 분자 차단에 15 밀리리터 분획으로 분할.
스윙 버킷 회전기를 사용하여 튜브를 4000회 G와 섭씨 4도에서 약 15분간 회전하여 각 분획이 1밀리리터 미만의 부피로 농축됩니다. 각 농축 된 용액 분획에 14 밀리리터의 희석 버퍼를 추가하고 농도 과정을 반복합니다. 그런 다음 분획을 결합하고 이전에 설명한 농도 공정을 사용하여 6 밀리리터의 부피에 농축한다.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 믹스를 준비합니다. 이 반응 믹스를 미리 지워진 용액의 6 밀리리터에 넣고 잘 섞습니다. 시약을 줄이는 162.5 마이크로리터를 추가하고 잘 섞습니다.
궤도 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 800rpm의 배양합니다. 이 후 5 밀리머 EDTA를 추가하고 5 분 동안 실온에서 궤도 셰이커에 인큐베이팅하여 반응을 담금질. 다음으로, 반응 혼합물을 50밀리리터 튜브 2개 사이로 나누고, 각각 4권의 미리 냉각된 메탄올을 포함하고 30분 동안 음수 섭씨 30도에서 배양한다.
원심분리기는 G 4000배, 섭씨 4도에서 15분 동안. 상체를 버리고 미리 차가운 메탄올의 1~2밀리리터를 펠릿에 넣습니다. 펠릿이 보이는 덩어리없이 완전히 중단되도록 펠릿을 분해하기 위해 위아래로 파이프.
원심분리 및 재서스펜션 프로세스를 두 번 반복합니다. 그 후, 펠릿을 방해하지 않도록 가능한 한 잔류 메탄올을 조심스럽게 꺼낸다. 10 밀리리터의 재구성 버퍼를 추가하고 펠릿을 녹이도록 위아래로 파이프를 넣습니다.
원심분리기는 G 4000배, 섭씨 4도에서 10분 간. 그런 다음 품질 관리를 위해 샘플의 20 마이크로 리터를 수집하는 새로운 튜브로 상체를 전송합니다. 세척 및 재구성된 샘플을 준비된 스트렙타비딘 아가로즈 구슬로 옮기.
하룻밤 동안 부드러운 회전과 섭씨 4도에서 배양. 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다. 품질 관리를 위해 샘플의 20 마이크로 리터를 수집할 수 있도록 새로운 튜브로 상체를 전송합니다.
10 밀리리터의 워시 버퍼 A.Incubate로 구슬을 12 rpm및 실온에서 10 분 동안 부드럽게 회전시 세척하십시오. 그런 다음 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다. 상체를 제거하고 세탁 및 원심 분리 과정을 다시 한 번 반복하십시오.
이 세척 과정을 반복하여 버퍼 B를 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 버퍼 C를 세척합니다. 그 후, 50 밀리머 트리스 염산염의 10 밀리리터로 구슬을 씻으시다. 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다.
상체를 제거하고 두 개의 1.5 마이크로 센세이퍼지 튜브 사이에 구슬을 균등하게 분할합니다. 포획된 RNP를 제외하기 시작하려면 400마이크로리터의 세척된 정착구슬에 준비된 비오틴 용출 버퍼 400마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1500 rpm에서 궤도 셰이커를 20분 동안 배양합니다.
그런 다음 1500 rpm과 섭씨 65도에서 10 분 동안 열 블록으로 궤도 셰이커에 배양하십시오. 구슬을 7800회 G로 1분간 원심분리하고 꺼진 RNP를 수집합니다. 400 마이크로리터의 신선한 비오틴 용출 버퍼를 비드에 추가합니다.
인큐베이션 및 원심분리 과정을 반복하여 두 번째 엘루트를 수집하고 두 개의 엘루스를 단일 15 밀리리터 튜브에 결합합니다. 다음으로, 결합된 RNP elutes에 3권의 희석 버퍼를 추가하여 SDS의 농도를 감소시다. 0.5 밀리리터 울트라 여과 튜브를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 약 40 마이크로리터에 농축합니다.
마이크로리터 RNase A당 0.5 마이크로그램을 추가하고 2시간 동안 섭씨 37도에서 배양하여 교차 연결된 RNase에서 RBP를 방출합니다. 품질 관리를 위해 두 개의 마이크로리터를 RP로 수집합니다. CARIC 프로토콜을 최적화할 때 품질 관리 단계가 중요합니다.
클릭 라벨이 부착된 샘플의 대표적인 품질 관리는 인겔 형광 분석을 통해 수행됩니다. 이중 표지된 샘플만이 교차 연결된 RNP의 신호를 나타내는 높은 분자량에서 강한 얼룩 밴드를 보여줍니다. RNP 신호는 4개의 SU 또는 EU를 생략하여 폐지됩니다. 또한 RNase를 사용하여 소화에 의해 폐지될 수 A.In 어떤 경우에는 4개의 SU 제어 샘플에서 강한 얼룩밴드가 관찰된다.
이 밴드는 대부분의 경우 열 내포화 중에 저하되는 레이블이 지정되지 않은 연결되지 않은 RNase를 나타냅니다. 선호도 투표 데이터의 품질 관리는 풀다운 전과 풀다운 후 샘플의 비오틴 신호를 보여주는 서부 블롯 분석을 통해 평가됩니다. 포획된 RBP의 은 염색 분석은 HeLa 세포의 경우 일반적인 총 포획 효율이 입력 단백질의 0.05~0.1% 사이임을 보여줍니다.
이 절차를 시도하는 동안 RNase는 ribonucleases에 민감하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. RNase의 탈색을 줄이기 위해 실험 환경을 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오. 이 절차에 따라 질량 분석법을 사용하여 단백질 알메이크 식별이 미리 형성되어 철 경계 단백질을 나타낼 수 있습니다.
개발 후 CARIC 기술은 직장에서 우편 전사 OT 규정을 보다 포괄적으로 이해할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.
