Этот метод, CARIC, может помочь ответить на ключевые вопросы в области пост-транскрипции рекреации генов путем проведения всеобъемлющей переписи РНК-связывающих белков. Основным преимуществом CARIC является его способность улавливать белки, связанные с различными видами РНК, такими как мРНК и некодирующие РНК. Этот метод может быть использован в различных типах и организм для изучения взаимодействия РНК белка на работе.
Во-первых, культура HeLa клеток в дополненных DMEM при 37 градусов по Цельсию в пять процентов CO2 атмосфере. Когда клетки достигают около 80 процентов слияния заменить культуру среды на каждом блюде с 15 миллилитров довоенной, свежей среде. Добавьте 15 микролитров 100 миллимоляров ЕС к каждому блюду к окончательной концентрации одного миллимолара.
Для экспериментальных и не УФ-контроль образцов добавить 7,5 микролитров 100 миллимоляров четыре SU к каждому блюду. Обложка блюда с фольгой и культуры клеток в течение 16 часов, используя предыдущие условия. После этого добавьте половину предыдущего количества ЕС и/или четырех SU к соответствующим пластинам и продолжайте культивирование еще два часа.
Для того чтобы начать in vivo cross-linking, извлекайте средство культуры и моете каждое тарелку 3 времени с PBS используя 5 миллилитров PBS в мытье. Удалите остаточный PBS как можно больше. Для экспериментальных и не четыре su контрольных образцов, поместите посуду на лед с крышкой удалены.
Используйте УФ-кросс-линкер для облучения клеток ультрафиолетовым светом на 365 нанометров и на двух юлях в квадрате. Чтобы не было образцов УФ-контроля, поместите посуду на лед и защитите их от света. Затем добавьте по миллилитр предлизного буфера к каждому блюду.
Используйте подъемник резиновых клеток, чтобы соскребать клетки и собирать суспензию прелиза в 15 миллилитровую трубку. Добавьте предлизный буфер в трубку, содержащую суспензию от двух блюд, регулируя общий объем до шести миллилитров. Затем добавьте равный объем буфера R лиза.
Пройдите клетку лизировать через шприц с узкой иглой несколько раз, пока лизат не станет ясным и однородным. Инкубировать лисат при четырех градусах по Цельсию с нежным вращением в течение одного часа. После этого разбавьте лисат в 20 томов разбавляемого буфера и разделите его на 15 миллилитров фракций в 15 миллилитров нетрафильтрационных трубках, молекулярное отрезание 10 килодальтонов.
Используя качающийся ротатор ведра, вращайте трубки при 4000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение примерно 15 минут, пока каждая фракция не будет сосредоточена в объеме менее одного миллилитра. Добавьте 14 миллилитров буфера разбавления к каждой концентрированной лизаторной фракции и повторите процесс концентрации. Затем объединить фракции и сконцентрировать их на объеме в шесть миллилитров, используя ранее описанный процесс концентрации.
Сначала подготовьте смесь реакции, изложенную в текстовом протоколе. Добавьте эту смесь реакции к шести миллилитров предварительно очищенного лизата и хорошо перемешайте. Добавьте 162,5 микролитров уменьшая реагент и хорошо перемешайте.
Инкубировать при комнатной температуре на орбитальном шейкере при 800 об/мин в течение двух часов. После этого утолить реакцию, добавив пять миллимолярной ЭДТА и инкубации на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем разделите реакционной смеси между двумя 50 миллилитров труб, каждая из которых содержит четыре тома предварительно охлажденного метанола и инкубировать при отрицательном 30 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
Центрифуга при 4000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте в гранулы от одного до двух миллилитров предварительно охлажденного метанола. Pipet вверх и вниз, чтобы разбить гранулы убедившись, что гранулы заканчивается полностью приостановлено без видимых кусков.
Повторите процесс центрифугации и повторного успения дважды. После этого, тщательно вытянуть остаточный метанол как можно больше убедившись, что не беспокоить гранулы. Добавьте 10 миллилитров буфера восстановления и трубы вверх и вниз, чтобы растворить гранулы.
Центрифуга при 4000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Затем перенесите супернатант в новую трубку, чтобы собрать 20 микролитров образца для контроля качества. Перенесите очищенный и восстановленный образец на подготовленные стриптавидин агарозные бусы.
Инкубировать при четырех градусах по Цельсию с нежным вращением на ночь. Спин вниз бисера на 4000 раз G в течение пяти минут. Перенесите супернатант в новую трубку, чтобы собрать 20 микролитров образца для контроля качества.
Вымойте бисер с 10 миллилитров мыть буфера A.Incubate с нежным вращением при 12 об/мин и при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем спина вниз бисера на 4000 раз G в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторите процесс мытья и центрифугации еще раз.
Повторите этот процесс мытья для мытья буфера B и мыть буфера C, как указано в текстовом протоколе. После этого вымойте бисер 10 миллилитров 50 миллимолярный гидрохлорид Tris. Спин бисер вниз на 4000 раз G в течение пяти минут.
Удалите супернатант и разделить бисер равномерно между двумя 1,5 микроцентрифуг трубки. Чтобы избежать захваченных РНК, добавьте 400 микролитров подготовленного буфера биотинового элюциона в 400 микролитров промытых, оседлых бусин. Инкубировать на орбитальном шейкере при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 20 минут.
Затем инкубировать на орбитальном шейкере с тепловым блоком при 1500 об/мин и 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Центрифуга бисера на 7800 раз G в течение одной минуты и собирать ускользает RNP. Добавьте в бисер 400 микролитров свежего биотинового буфера.
Повторите инкубационный процесс и центрифугирование, чтобы собрать вторую элюту и объединить два элюта в одну 15 миллилитровую трубку. Затем добавьте три тома буфера разбавления к комбинированным RNP elutes, чтобы уменьшить концентрацию SDS. Используя 0,5 миллилитровую ультрафильтральную трубку, сосредоточьте образец примерно до 40 микролитров, как указано в текстовом протоколе.
Добавьте 0,5 микрограмма на микролитер RNase A и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы освободить RBPs от перекрестных RNase. Соберите два микролитров RBPs для контроля качества. При оптимизации протоколов CARIC шаги контроля качества имеют решающее значение.
Репрезентативный контроль качества помеченных щелчок образцов осуществляется с помощью анализа флуоресценции в геле. Только вдвойне помеченный образец показывает сильную полосу мазка при высоком молекулярном весе, который представляет собой сигнал перекрестных РНК. Сигнал RNP отменяется, опуская либо четыре SU или ЕС. Он также может быть отменен путем пищеварения с RNase A.In в некоторых случаях сильная смазанная полоса наблюдается в no four SU контрольный образец.
Эта полоса представляет помечены uncross-связанных RNase, которые будут деградировать во время жары innaturation в большинстве случаев. Контроль качества данных опроса сродства оценивается с помощью западного анализа помарки, который показывает сигналы биотина в образцах как до стягивания, так и после стягивания. Анализ окрашивания серебра захваченных RBPs показывает, что для клеток HeLa общая эффективность захвата составляет от 0,05 до 0,1 процента входных белков.
При попытке этой процедуры важно помнить, что RNase чувствительны к рибонуклеям. Держите экспериментальную среду как можно более чистой, чтобы уменьшить угрюмый RNase. После этой процедуры, идентификация протеина almake используя масс-спектрометрию можно preformed для того чтобы показать утюг-связанные протеины.
После его разработки методика CARIC проложит путь к более всестороннему пониманию регулирования ОТ почтовой транскрипции на работе.
