Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenómica demostrando cómo diseñar e implementar una herramienta basada en la secuenciación para evaluar el impacto de los factores ambientales en la metilación del ADN. La principal ventaja de esta técnica es que puede proporcionar un método más completo y cuantitativo para evaluar los niveles de metilación del ADN en comparación con las plataformas basadas en matrices. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la identificación de los cambios de metilación del ADN debido a diferentes tipos de procesos fisiológicos en cualquier organismo cuyos datos de secuencia estén disponibles.
Aunque este método puede proporcionar información sobre el impacto del estrés en la metilación del ADN, también se puede aplicar a otros factores ambientales o condiciones fisiológicas, como la exposición a tóxicos ambientales en la dieta alta en grasas y condiciones como la diabetes y las enfermedades cardiovasculares. Después de cortar el ADN y verificar el tamaño a través de bioanalyzer, agregue 180 microlitros de perlas magnéticas que unen el ADN a cada muestra, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Pele las perlas en una placa magnética, y retire el sobrenadante.
Resuspender el pellet en 200 microlitros de 70% etanol. A continuación, utilice una placa magnética para peletizar las perlas y retire tanto etanol como sea posible. Seque las cuentas en un bloque de calor a 37 grados Centígrados durante tres a cinco minutos.
Luego, resuspender el pellet en 44 microlitros de agua libre de nucleasas, y recoger aproximadamente 42 microlitros del sobrenadante. Después de ligar los adaptadores y verificar la ligadura a través de bioanalyzer, transfiera las muestras a tubos de microcentrífuga de baja unión al ADN. A continuación, utilice un concentrador de vacío calentado para reducir el volumen de la muestra por debajo de 3,4 microlitros.
Después de esto, añadir 5.6 microlitros de Methyl-Seq Block Mix a cada muestra, e incubarlos en un ciclor térmico. Prepare Capture Library Hybridization Mix según el protocolo de texto. A continuación, agregue 20 microlitros de Capture Library Hybridization Mix a cada muestra e incubar a 65 grados centígrados durante 16 horas.
Hacia el final del período de incubación, prepare cuentas magnéticas de estreptavidina añadiendo 50 microlitros de cuentas magnéticas de estreptavidina por muestra a un nuevo tubo de tira de ocho pocóditos. Lave las perlas con 200 microlitros de Tampón de unión metilo-seq. Coloque el tubo de tira en una placa magnética y retire el sobrenadante de las perlas.
A continuación, resuspender las perlas en 200 microlitros de búfer de unión metil-seq. Agregue las muestras a las perlas de estreptavidina lavadas e iclerándolas a temperatura ambiente durante 30 minutos en un mezclador giratorio. Mientras que las muestras se mezclan, aliquot 200 microlitros de Methyl-Seq Wash Buffer Two en pozos triplicados de una placa de 96 pozos y precalentado a 65 grados Celsius.
Después de la incubación de las muestras, pele el cordón magnético con una placa magnética y retire el sobrenadante. Luego, resuspender las cuentas en 200 microlitros de Methyl-Seq Wash Buffer One. Incubar las perlas durante 15 minutos a temperatura ambiente, y utilizar una placa magnética para quitar el sobrenadante.
Después de esto, resuspender el pellet de perlas en 200 microlitros de Wash Buffer Two precalegado. Luego, incubar las perlas en un ciclor térmico antes de usar una placa magnética para peletizar las perlas. Añadir 20 microlitros de Tampón de elución metilo-seq a las cuentas lavadas, e incubarlos a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Utilice una placa magnética para peletizar las perlas, y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de tira. En primer lugar, añada 130 microlitros de reactivo de conversión de bisulfito al sobrenadante previamente recogido. Divida las reacciones de 150 microlitros por igual en dos pozos.
Luego, incubar las reacciones en un ciclista térmico. Utilice 600 microlitros de Búfer de enlace para unir las muestras a las columnas de giro y lave las columnas con 100 microlitros de Wash Buffer. A continuación, centrifugar las columnas y deseche el flujo a través.
Después de esto, agregue 200 microlitros de Zona de desulfona a las columnas. Incubar las columnas durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente. Lave las columnas dos veces con 200 microlitros de Wash Buffer.
A continuación, agregue 10 microlitros de Elution Buffer a la columna. Incubar a temperatura ambiente y centrífuga. Prepare la mezcla maestra de reacción PCR de acuerdo con el protocolo de texto.
A continuación, añada 82 microlitros de la mezcla maestra a cada muestra e incubar las muestras en un ciclor térmico. En primer lugar, prepare el PCR Master Mix Two sobre hielo de acuerdo con el protocolo de texto. Luego, a cada muestra, agregue 25,5 microlitros de PCR Master Mix Dos y cinco microlitros de imprimadores de indexación comercial, e incubar las muestras en un ciclor térmico.
Evaluar la concentración de ADN de las muestras con reactivos de detección de ADN de alta sensibilidad en un bioanalizador. A continuación, las bibliotecas Methyl-Seq se envían para su secuenciación en el secuenciador de próxima generación. Después de la conversión de bisulfito y la validación de amplificación de PCR, prepare una mezcla maestra con búfer de unión, agua y perlas de sepharosa recubiertas de estreptavidina.
A continuación, agregue 75 microlitros de la mezcla maestra y cinco microlitros del producto PCR anidado a una placa de 96 pozos, y agite la placa en una coctelera de placa durante 15 a 60 minutos. Mientras la placa tiembla, agregue 12 microlitros de imprimación a los pozos de una placa de ensayo de pirosecuenciación. Después de agitar, coloque una herramienta de vacío en una vaguada llena de agua y, a continuación, coloque la herramienta en la placa con reacciones de unión.
A continuación, sumerja la herramienta de vacío en vaguados medio llenos que contengan 70%etanol, hidróxido de sodio y tampón de tris-acetato. Desconecte el vacío y coloque la herramienta de vacío en la placa de ensayo de pirosecutor HS para transferir las perlas. Coloque la placa sobre un bloque de calor e incubar a 80 grados centígrados durante dos minutos.
Finalmente, deje que la placa se enfríe durante cinco minutos antes de comenzar el programa pyro. En este protocolo, el análisis de las bibliotecas metil-seq proporcionó una lista clasificada de regiones metiladas diferencialmente, o DMR, entre animales estresados y no estresados y una gráfica de los DMR. Validación a través de pirosecuenciación bisulfita mostró que todos los animales estresados exhibieron niveles de metilación más altos en todos los CpGs que los animales no humanos.
Los niveles de metilación en CpG 10 también se compararon con la media de los niveles de CORT de tres semanas para cada animal. Los resultados indican que existe una correlación modesta entre los datos endocrinos y de metilación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar comparar el aumento en el tamaño promedio del ADN entre los pasos de cizallamiento de ADN y ligadura del adaptador y asegurar una cantidad suficiente de biblioteca antes de la secuenciación.
Siguiendo este procedimiento, se pueden implementar otros enfoques similares para responder a preguntas novedosas, como el impacto de los tóxicos ambientales en el neurodesarrollo de ratas. Después de su desarrollo, esta técnica proporcionó los medios para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran los cambios de metilación del ADN en todo el genoma en cualquier organismo no modelo o modelo donde se disponga de secuencias genómicas. No olvide que trabajar con las enzimas sensibles a la temperatura requiere almacenamiento en hielo mientras está en uso y almacenamiento en el congelador de menos 20 grados.
Las perlas de ARN utilizadas para la captura de objetivos requieren descongelación y almacenamiento en hielo mientras está en uso y almacenamiento a largo plazo en el congelador de menos 80 grados.
