Bisulfito de conversión de protocolo Un protocolo estándar para la conversión de 2 mg de ADN genómico se describe a continuación. Cantidades más pequeñas o más grandes de ADN genómico (100 pg-200 mg) puede también ser tratado con éxito de bisulfito. Estas condiciones de reacción como resultado una conversión completa (99,5 a 99,7%) de casi todas las secuencias de ADN objetivo del 3. 1. Preparación de ADN Preparación de muestras mediante la incubación de ADN genómico con bisulfito de buffer de lisis de ADN (2 ug de ARN t, 280 ng / l de proteinasa K, 1% SDS) en un volumen total de 18 l durante 1 hora a 37 ° C. Nota: Esto es importante para lograr conversión de bisulfito de máxima, especialmente con el ADN aislado de muestras clínicas, donde todavía puede haber proteína asociada con el ADN. 2. Desnaturalización del ADN <ol><li> Desnaturalizar 2 mg de ADN en un volumen de 20 l mediante la adición de 2 l de recién preparada 3M NaOH a una final de concentration de 0,3. </li><li> Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 minutos en un baño de agua, seguido de incubación a 90 ° C durante 2 minutos en un bloque de calor. Inmediatamente se colocan los tubos en hielo durante 5 min. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 º C durante 10 s de 10.000 g, para asegurar que el ADN se encuentra en la parte inferior del tubo. </li></ol> 3. La desaminación de bisulfito Sulfonación y desaminación hidrolítica <ol><li> Prepare nuevas soluciones de 10 mM de sodio y grasas saturadas Quinol pH 5,0 metabisulfito (7,6 g de Na 2 S 2 O 5, con 464 l de 10 M NaOH, de hasta 15 ml con agua). La solución de bisulfito de sodio saturado se logra invirtiendo suavemente el reactivo / H 2 O mezcla, con la mezcla mínima y la aireación. Si es necesario, ajustar el pH con NaOH 10 M, para la disolución completa de la Nota de metabisulfito:. Como se trata de una solución saturada, pequeños bultos todavía no se han disuelto. </li><li> Añadir 208l de la metabisulfito saturada y 12 l de 10 mM Quinol al ADN desnaturalizado (20 l), en un volumen final de 240 l con una concentración final de 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5,0. Mezclar suavemente todos los reactivos y centrifugar durante 10 segundos para asegurar todas las gotitas están en el fondo del tubo. </li><li> Superposición de las muestras con 200 l de aceite mineral. Incubar las muestras a 55 ° C en un baño de agua, de 4.16 hrs. La duración del tratamiento bisulfito depende de la cantidad y la calidad del ADN que se va a convertir. Para el ADN de mala calidad o ADN degradado, limitar el tiempo de incubación de 4 horas. Nota: es importante que los que la conversión de bisulfito se lleva a cabo en la oscuridad para evitar la oxidación, por lo que si que no es posible envolver los tubos en papel de aluminio antes de la incubación . </li><li> Al final del tiempo de incubación adecuado, girar los tubos brevemente en un microcentrífuga para asegurar que todo el líquido se encuentra en la parte inferior del tubo. </li><li> Recuperar el ADN de bisulfito de tratadospor debajo de la capa de aceite con cuidado pipeteando la solución de ADN de la parte inferior del tubo, sin ocupar ninguno de los aceites minerales. </li></ol> Desalación <ol start="5"><li> Eliminar cualquier iones bisulfito libre al pasar a través de una columna de la desalación y eluyendo en 50 l de agua milli-Q (MQH 2 O). Dependiendo de la cantidad y la calidad del ADN genómico y cómo se prepara, distintas columnas de la desalación se puede utilizar. Nosotros usamos Promega Asistente para limpieza de columnas, ya que estas columnas son adecuados para eliminar el SDS utilizados en la preparación del ADN antes de la conversión. </li></ol> Desulphonation álcali <ol start="6"><li> El aducto de bisulfito se retira el anillo de uracilo por desulphonation. Desulphonate mediante la adición de 5,5 l de recién preparada 3M NaOH a una concentración final de 0,3 M, luego incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifugar brevemente y agregar 1 l de ARN t (10 mg / ml). </li> &lt;li&gt; Neutralizar la solución con la adición de 33 l de acetato de amonio (NH 4 Ac O), pH 7,0 a una concentración final de 3M. </li><li> Etanol precipitar el ADN mediante la adición de 330 l de helado 100% de etanol, mezclar bien por inversión. Dejar en-20μC durante 1 hora o toda la noche. Centrifugar a 14.000 g durante 15 min a 4 ° C. Eliminar todos los rastros de sobrenadante y secar al aire el ADN se precipitó a ~ 20 min. </li><li> Vuelva a suspender el pellet de ADN en 50 l / g de 0,1 O. TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) o H 2 Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. De vez en cuando los tubos de vórtice para asegurar que el ADN se disuelve, seguido por una centrifugadora rápida. </li><li> Uso inmediato para la amplificación de PCR, o almacenar a -20 ° C durante 10-10 años, dependiendo de la cantidad y la calidad del ADN. </li></ol> 4. Amplificación Primer diseño <ol><li> Diseño efectivo de PCR bisulfito de conversión de los primers específicos es crucial para asegurar que la amplificación eficiente e imparcial de ADN completamente convertido ocurre. Las siguientes pautas se utilizan para ayudar al diseño de imprimación. </li></ol> Directrices diseño de la cartilla <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg" /> Thermocyling <ol start="2"><li> Para la prueba de amplificación de PCR proporcional de ADN metilado y no metilado, use un metilados 50:50 / Unmethylated totalmente bisulfito de la muestra de control convierten y amplifican con el bisulfito de conversión de cebadores específicos de las condiciones de reacción optimizadas PCR (Figura 3). Para el 50:50 metilados: Unmethylated control, el uso in vitro de ADN metilado y LICE ya sea de todo el genoma amplificado (WGA) de ADN o de ADN de sangre total. Tenga en cuenta que algunos genes se metila naturalmente en la sangre y por lo tanto, en estos casos lo mejor es usar sólo WGA ADN como el &quot;Unmethylated&quot; de control. </li><li> Prepare las mezclas de amplificación de PCR en 100 &amp; mu; alícuotas l que contiene 2 l de bisulfito de ADN genómico convertidos, 200 mM dNTP, cebadores 1 M, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 y 0,15 l de Taq polimerasa. </li><li> En un termociclador de gradiente de temperatura, ajuste la reacción se ejecutan en un gradiente de + / - 3 ° C en la predicción de Tm de la cartilla a través de 10 tubos </li></ol><img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" /><ol start="5"><li> Para probar que los amplicones metilado y no metilado se han ampliado en proporción, la amplificación puede ser digerido con una enzima de restricción informativa, como Taq 1 (TCGA), que va a digerir ADN metilado, pero no va a digerir ADN no metilado en el sitio de la enzima de restricción es alterada después de la conversión de bisulfito de TTGA. La extensión de la digestión puede ser visualizado por electroforesis en gel de agarosa (Figura 3). Por otra parte, SYBRGreen (0,2 l de dilución 1:1000) se puede agregar a la reacción de PCR yel grado de metilación puede ser evaluado mediante la realización de las parcelas de calor de disociación en un termociclador en tiempo real PCR (Figura 3B). </li><li> Mezcla de reacción PCR incluyendo MgCl2 condiciones de concentración y termociclado posible que tenga que ser ajustada para aumentar la eficiencia de la PCR o para asegurar una amplificación proporcional PCR de los fragmentos de PCR desnaturalizado y no metilado. </li><li> Una vez que las condiciones de PCR han sido optimizados, la amplificación por PCR se puede realizar en muestras de bisulfito convertidos. Nota: Una vez que la Tm se ha optimizado un gradiente de temperatura PCR no es necesario usar. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Un ejemplo de optimización de bisulfito de amplificación por PCR se muestra en la Figura 3. Condiciones óptimas de amplificación por PCR se amplifican amplicones metilados y no metilados en proporción y sin prejuicios. La figura 3A muestra un gel de agarosa con un perfil de gradiente de temperatura amplificación por PCR a partir de una mezcla de ADN metilado 50% y no metilado. ªe amplicones de la PCR se han tratado con una enzima de restricción Taq 1 (TCGA), que se digieren metilada (M) de ADN, pero no va a digerir no metilados (U) de ADN, como el sitio de la enzima de restricción se ve alterada por la conversión de bisulfito de TTGA. Una cantidad igual de cortar y cortar producto de PCR se espera si el ADN metilado y no metilado se amplifica en proporción. Se puede ver en este gel que las condiciones óptimas para thermocyling no sesgo de amplificación es de 56,1 ° C (T). Conversión completa del ADN de bisulfito también pueden ser analizados por la digestión con la enzima citosina-sitio específico, como Hpa III (CCGG). Hpa III sólo digerir si la conversión ha fallado, como el sitio de restricción se mantendrá. Si la conversión se ha completado el sitio de restricción se convierte en TCGG o TTGG dependiendo del estado de metilación del ADN. Conversión completa de ADN de bisulfito se puede ver en la figura 3A (H). Figura 3B muestra una gráfica de tiempo real que la disociaciónTambién se puede utilizar como una herramienta para determinar si existe algún sesgo de amplificación basada en la temperatura a la que las diferentes moléculas se disocian. En esta figura se puede observar que el PCR ha amplificado desnaturalizado (M) y el ADN metilado (U) en proporción de una mezcla de ADN de 50% metilado y unmethylated en comparación con la amplificación de ADN de control totalmente metilado y unmethylated que se disocian en 82.1μC y 78.9μC respectivamente. Después de la optimización de las condiciones de reacción y thermocyling bisulfito muestras tratadas pueden ser amplificados con primers específicos capítulo específico y bisulfito, ya sea en una sola reacción anidada o semi-PCR. El resultado de fragmentos de PCR puede ser visualizado por electroforesis en gel de agarosa y se secuencia, ya sea directamente (Figura 4) o por la clonación y secuenciación. Después de la clonación y la secuenciación del estado de metilación de las moléculas individuales pueden ser identificados con claridad en un mapa de bisulfito (Figura 4B), para visualizar la heterogeneidad demetilación. Análisis de alto rendimiento cuantitativo de metilación puede ser preformado uso de la tecnología, como la utilizada por el método EpiTYPER Sequenom. El uso de este método, el ADN se amplifica bisulfito convertido con bisulfito de cebadores específicos de PCR y seguido por un proceso de división proprietry. Los fragmentos resultantes se cuantifican por espectrometría de masas MALDI-TOF con el espectro específico depende de la presencia de citosinas metiladas (Figura 5). Un resumen de los ratios de metilación en la muestra puede ser extrapolado en forma de un epigrama (Figura 5) o la trama de metilación (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática CpG metiladas. En la célula normal, el promotor asociado a las islas CpG son en su mayoría no metilados (gris), mientras que los sitios CpG en los órganos de genes son escasos y, en general metilado (rojo). El panel de la derecha se expande la estructura molecularUre de ADN en un sitio CpG individuales y muestra la metilación con una molécula de CH3 en el carbono 5 de citosina. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" /> Figura 2. . Químicos esquema de conversión de Análisis de la metilación del ADN consta de cuatro etapas principales que se muestra, la desnaturalización, la conversión de bisulfito, amplificación por PCR y análisis. En el panel derecho, las modificaciones de la molécula de citosina que se producen durante la conversión de bisulfito se muestran. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" /> Figura 3. La optimización de la amplificación por PCR. A. Agarosa por electroforesis en gel con un perfil de gradiente de temperatura amplificación por PCR a partir de una mezcla de ADN metilado 50% y no metilado. Los fragmentos se han digerido con Taq1 (T) o HpaIII (H) que digieren el ADN metilado y no el ADN de bisulfito convertidos respectivamente. B. Calor análisis de la curva de disociación muestra una ecuaciónl porcentaje de ADN metilado y no metilado (línea roja mezcla 50/50) en comparación con el control de amplificación completamente metilado (línea rosa, M) y el ADN metilado (línea verde, U), que se disocian en 82,1 ° C y 78,9 ° C respectivamente. <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" /> <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" /> Figura 4. Ejemplo de secuenciación directa y un mapa de bisulfito. A. Secuencia de traza a partir de tres líneas celulares diferentes con los sitios CpG resaltado en amarillo. La línea celular de X muestra el 100% de metilación en los tres sitios CpG, mientras que las líneas celulares Y y Z muestran distintos grados de metilación como se ve por la superposición de G / A las señales. B. Representante de bisulfito de mapa que muestra la densidad de metilación (puntos rojos) en los respectivos sitios CpG, según lo determinado por secuenciación directa de los distintos clones. <img alt="Figura 5 bis" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" /> Figura 5. ADN de alto rendimiento con el análisis de metilación Sequenom. A. Espectro de vista utilizando la tecnología Sequenom epiTYPER. Fragmentos de ADN mostrar espectros específicos, dependiendo de la cantidad presente de la metilación del ADN. B. Epigrama resumen del porcentaje de metilación del ADN en cada sitio CpG de cuatro líneas diferentes de células. La metilación C. resumen de la trama derivada de la Epigrama Sequenom.

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El análisis de metilación del ADN mediante la secuenciación del genoma de ADN de bisulfito convertido es un método bien establecido y versátil que facilita la identificación y cuantificación de la metilación del ADN en la resolución de un solo nucleótido. Sin embargo, la conversión de bisulfito y posterior análisis se basa en la premisa de que el ADN ha sido completamente renovado con cada citosina no metilados se desaminada a uracilo y sólo citosinas metiladas restantes no-reactiva. Si la conversión es incompleta, pueden surgir problemas con el análisis ya que no convertidos citosinas no metiladas puede ser interpretado erróneamente como citosinas metiladas. Bisulfito de conversión puede ser optimizado en varias etapas para maximizar el porcentaje de conversión. De ADN para convertirse completamente en primer lugar, debe ser una sola cadena para que los residuos de citosina están expuestos a los iones bisulfito. El primer paso, la desnaturalización del ADN, es crítica y puede ser el origen de la conversión incompleta si el ADN no está totalmente desnaturalizado. A fin de garantizarque el ADN está completamente desnaturalizado es importante que los parámetros de reacción incluyendo la eliminación de todas las proteínas asociadas, la concentración de sal adecuado, la temperatura de incubación y el tiempo son adecuadas para mantener el ADN en la conformación de cadena sencilla. Es importante la utilización de nuevas NaOH 3M y para permitir que el tiempo de incubación adecuado. Si el ADN se resiste a la desnaturalización, algunas modificaciones en el protocolo, incluidos la ampliación del tiempo de incubación a 30 minutos o la fragmentación del ADN antes de la desnaturalización puede facilitar la desnaturalización del ADN. Además, el ADN de cadena sencilla (ssDNA) puede volver a recocer a ADN de doble cadena (dsDNA) durante la reacción de conversión de bisulfito. Llevar a cabo la reacción a una temperatura más alta (90-95 ° C) de manera periódica o continua durante la reacción de bisulfito puede ayudar al mantenimiento de ssDNA. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la degradación del ADN se acelera enormemente a estas temperaturas altas. Varios reactivos también se pueden añadir a interrumpir re-recocido de the hebras de ADN, como la urea. La concentración de ADN y su calidad también puede afectar la eficiencia de la reacción de bisulfito y última producción de PCR. La degradación del ADN es una limitación de la conversión de protocolos de bisulfito. El tratamiento químico del ADN presenta varios picos en la cadena de ADN de cadena simple y algunas de las duras condiciones necesarias para la conversión completa de bisulfito incluyendo la concentración de bisulfito de alto, largos tiempos de incubación puede acelerar la degradación del ADN. Bajo las condiciones de reacción estándar descrito, la degradación del ADN no es un problema común, sin embargo, si las modificaciones del protocolo se introducen, por ejemplo, para las secuencias que son refractarios a la conversión, para las plantillas de ADN que se degradan o de mala calidad, tales como muestras de FFPE, entonces la degradación del ADN puede convertirse en una limitación importante. Formol e incluidos en parafina fijo, (FFPE) y muestras de ADN degradado puede ser efectivamente bisulfito de convertir y amplificado utilizando este protocoloSin embargo, las modificaciones para asegurar que el ADN no se degrada aún más se recomienda. El uso de un carrier RNA como t ARN se recomienda. También el glucógeno se puede agregar como un portador cuando la concentración de ADN es baja (&lt;200 ng). Dado que el ADN aislado de los tejidos FFPE ya está fragmentado y una mayor fragmentación lleva a cabo durante la desaminación, se debe tener cuidado para minimizar la degradación. No los fragmentos de ADN más lejos antes de la desnaturalización y limitar el tiempo de incubación de la reacción de bisulfito de 4 horas. Diseño amplicones no mayor de 300 pb, debido a ADN fragmentado. Otro factor que puede afectar a la amplificación por PCR que la conversión de bisulfito de citosinas no metiladas reduce la complejidad de la plantilla de ADN. El protocolo de diseño de la cartilla siguiente se describe en la sección 4.1, una mayor duración de imprimación y PCR, pueden ayudar a aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR. Por último, desde la plantilla de ADN se altera durante bisulphite de conversión, el sesgo de amplificación puede ser una preocupación. Asegúrese de que proporcional de la amplificación por PCR de plantillas metilado y no metilado se comprueba con un control de 50/50 M / U mezcla de ADN, como se indica en el protocolo, vea la Figura 3. Asegúrese también de que la amplificación de las plantillas sólo se convierten está ocurriendo utilizando la enzima de restricción HpaIII y electroforesis en gel (Figura 3). Las condiciones de PCR puede ser necesario optimizar variando la concentración de la temperatura y / o magnesio o alargar el tiempo de prórroga. Algunas plantillas parecen ser particularmente problemático y la posición de imprimación puede ser necesario ajustar o degenerados posible que tenga que ser utilizado. Próxima generación de técnicas de secuenciación están evolucionando rápidamente para conseguir una resolución similar a la secuencia genómica de bisulfito, y la secuencia de la tercera generación de una sola molécula tiene el potencial de permitir un análisis tanto de primaria del ADN y la metilación, sin la necesidad de que la secuenciación de bisulfito. Sin embargo, la amplia disponibilidad y especificacionesificity de estas técnicas siguen siendo un tiempo lejos. La secuenciación genómica de bisulfito es el estándar de oro en el análisis de metilación y es un protocolo robusto. El método ha progresado hasta el punto en el que los problemas comunes y las limitaciones han sido resueltos y las aplicaciones se han ampliado a partir de análisis de genes individuales de alto rendimiento y el análisis del genoma completo descrito por Clark et al. 4 2006. Instrucciones para resolver problemas y recomendaciones adicionales se describen en la Tabla 1. Se sugiere que el enfoque óptimo es seguir inicialmente el protocolo estándar y sólo introduce modificaciones siempre y cuando surge un problema. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tabla 2" /> Tabla 1. Instrucciones para resolver problemas

<ol><li> Metabisulfito de sodio (Ajax Finechem) </li><li> Hidroquinona (Merck) </li><li> Asistente de ADN de limpieza del sistema (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

La epigenética se describen los cambios heredables en la función génica que se producen independientemente de la secuencia de ADN. Las bases moleculares de la regulación epigenética de los genes es complejo, pero esencialmente implica modificaciones en el propio ADN o las proteínas con las que se asocia el ADN. La modificación epigenética del ADN predominante en los genomas de los mamíferos es la metilación de los nucleótidos citosina (5-MEC). Metilación del ADN proporciona instrucciones a la maquinaria de expresión genética en cuanto a donde y cuando el gen debe expresarse. La secuencia de prioridad para la metilación del ADN en los mamíferos es el 5&#39;-CpG-3 &#39;dinucleótidos (Figura 1). Dinucleótidos CpG no están distribuidos uniformemente a lo largo del genoma, pero se concentran en las regiones de las secuencias genómicas repetitivas y CpG &quot;islas&quot; comúnmente asociados con los promotores de genes (Figura 1). Los patrones de metilación del ADN se establecen temprano en el desarrollo, modulado durante la diferenciación de tejidos específicos e interrumpido en muchas enfermedades incluyendo el cáncer. A understand el papel biológico de la metilación del ADN y su papel en las enfermedades humanas, precisa, eficiente y reproducible métodos son necesarios para detectar y cuantificar cada cinco-MEC. Este protocolo para la conversión de bisulfito es el &quot;gold standard&quot; para el análisis de metilación del ADN y facilita la identificación y cuantificación de la metilación del ADN en la resolución de un solo nucleótido. La química de la desaminación de citosina por bisulfito de sodio en tres etapas (Figura 2). (1) sulfonación: La adición de bisulfito al enlace doble 5-6 de la citosina (2) La desaminación hidráulica: desaminación hidrolítica de las resultantes citosina-bisulfito de derivados para dar un derivado de uracilo-bisulfito (3) Desulphonation álcali: La eliminación de la sulfonato grupo por un tratamiento alcalino, para dar el uracilo. Bisulfito de preferencia desamina citosina a uracilo en el ADN de cadena sencilla, mientras que cinco-MEC, es refractaria a bisulfito mediada por desaminación. Tras la amplificación por PCR, el uracilo se amplificacomo timina mientras que el 5-MEC residuos permanecen como citosinas, lo que permite metilado CpGs deben distinguirse de los CpGs metilado por la presencia de una citosina &quot;C&quot; frente a la timina &quot;T&quot; de residuos durante la secuencia. Modificación del ADN mediante la conversión de bisulfito es un protocolo bien establecido que puede ser explotado para muchos métodos de análisis de metilación del ADN. Desde la detección de 5-MEC por la conversión de bisulfito se demostró por primera vez por Frommer et al. 1 y Clark et al. 2, en torno a los métodos de conversión de bisulfito de la cuenta de ADN genómico para la mayoría de los nuevos datos sobre la metilación del ADN. Diferentes métodos de análisis post PCR puede ser utilizada, en función del grado de especificidad y la resolución de la metilación del necesario. La clonación y secuenciación sigue siendo el método más fácil acceso que puede dar solución de un solo nucleótido para la metilación a través de la molécula de ADN.

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DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

El estándar de oro para el análisis de metilación del ADN es la secuencia del genoma de ADN de bisulfito de convertir. Este método tiene la ventaja de la mayor sensibilidad de la citosina en comparación con el 5-metilcitosina (5-MEC) de bisulfito de desaminación en condiciones ácidas. Citosinas no metiladas se puede distinguir de citosinas metiladas después de la amplificación por PCR del DNA genómico de destino.

La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

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Research

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Biology

103.8K vistas.  Garvan Institute of Medical Research. El estándar de oro para el análisis de metilación del ADN es la secuencia del genoma de ADN de bisulfito de convertir. Este método tiene la ventaja de la mayor sensibilidad de la citosina en comparación con el 5-metilcitosina (5-MEC) de bisulfito de desaminación en condiciones ácidas. Citosinas no metiladas se puede distinguir de citosinas metiladas después de la amplificación por PCR del DNA genómico de destino.

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PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS fabricación de dispositivos y modificación de la superficie

Investigación

Biología

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

Modificación genética y recombinación de las Glándulas Salivales culturas de órganos

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reducción de gravedad Demostraciones entorno de hardware de un prototipo miniaturizado citómetro de flujo y Compañero Microfluidos Tecnología de mezcla

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...