We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

Todos los procedimientos ejecutados son aprobados por la Escuela de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Indiana y siguen Instituto Nacional de Salud directrices. 1. Técnica quirúrgica <ol><li> Mantenga una técnica aséptica durante este procedimiento mediante el uso de guantes estériles, instrumentos, y un campo quirúrgico estéril de acuerdo con las directrices del NIH 25. Esterilizar las herramientas antes de comenzar la cirugía mediante autoclave (véase la Tabla de específico Reactivos / Equipo para la lista completa). Utilice un esterilizador de perlas de vidrio para esterilizar las herramientas durante la operación. </li></ol> 2. Anestesia y Preparación <ol><li> Anestesiar al ratón en una caja de la anestesia con una mezcla de 0,9 L / min de oxígeno y 2,5% de isoflurano usando un sistema de vaporizador de isoflurano veterinaria. Asegúrese de que el ratón no responde a los cambios en la posición del cuerpo antes de sacarlo de la caja. </li><li> Aplicar pomada oftálmica al mouLos ojos de sí para protegerlos de la desecación. </li><li> Cambie el flujo de gas de la caja para el cono de la nariz. Coloque el ratón en ángulo recto en su lado izquierdo en una almohadilla de cubierta climatizada con una almohadilla quirúrgica y papel absorbente banco con su nariz y la boca en el interior del cono. Monitorear continuamente el ritmo respiratorio del ratón y la velocidad y ajustar los niveles de isoflurano según sea necesario (entre 2,5-3% isoflurano) para mantener un nivel adecuado de anestesia, y usar el pellizco reflejo dedo para confirmar la sedación total. </li></ol> 3. Abordaje quirúrgico <ol><li> Alinear y centrar el estereoscopio con el campo quirúrgico. Ajuste el cono de la nariz y la cinta hacia abajo para que se coloca a lo largo del borde del campo visual. </li><li> Con el ratón acostado en su lado izquierdo, con cinta adhesiva el borde de la oreja derecha al cono de nariz, la exposición del área detrás de la oreja donde se realizará la incisión. Asegúrese de que la vena auricular posterior se desplaza horizontalmente a través de la oreja. Tenga en cuenta que la colocación correcta de tque los animales y la grabación de la oreja son cruciales para encontrar rápidamente el nervio facial. </li><li> Humedezca la piel en y detrás de la oreja con etanol al 70% y afeitar el sitio quirúrgico utilizando una hoja de afeitar o bisturí. Pre-humedecer la piel hace que el afeitado más fácil en esta localización anatómica. </li><li> Limpiar la piel con una solución de yodo, tales como lavado quirúrgico Betadine (7,5% de povidona-yodo), seguido por etanol al 70%. Repita esta limpieza dos veces más para desinfectar a fondo el área. </li><li> Para determinar dónde hacer la incisión, traza la vena auricular posterior de la oreja caudalmente a la zona posterior a la protuberancia oído. Usando tijeras de primavera, hacer una incisión de 4 mm 2 - 3 mm posterior a la protuberancia. </li><li> Diseccionar a través de la grasa subcutánea y la máscara con disección roma. Evite el corte directo con las tijeras porque los vasos sanguíneos o tejido muscular podrían dañarse fácilmente. </li><li> Si se produce sangrado, aplique presión en el sitio de la cirugía con un hisopo de algodón estérildurante al menos 30 seg. Si se produce la pérdida de fluido significativa, inyectar el ratón por vía intraperitoneal con hasta 0,5 ml de solución salina al 0,9% estéril usando una aguja G 25 o 27. </li><li> Utilice varios hitos clave, el nervio espinal accesorio, canal auditivo, y anterior del músculo digástrico (descrito más adelante), para localizar el nervio facial. Diseccionar alrededor de estos puntos de referencia hasta que se visualizan las ramas del nervio facial. El nervio aparecerá como una estructura de sólido blanco significativa cuando se revela y una capa de fascia se adhiere a las estructuras subyacentes. <ol><li> Encuentra el nervio espinal accesorio, que viaja de la porción caudal del cráneo para inervar el músculo trapecio, una vez que la grasa subcutánea y la fascia se han diseccionado. El nervio facial es profundo en el nervio espinal accesorio. </li><li> Encuentra el conducto auditivo cartilaginoso que se ve de color blanco nacarado y se puede ver rostral al nervio facial. </li><li> Encontrar el vientre muscular del músculo digástrico anterior que se encuentra en la parte superior de y caudal al nervio facial. </li></ol></li><li> Cuando se visualizan las principales ramas del nervio facial, rastrearlos dorsal para encontrar su origen en el agujero estilomastoideo. Utilizando pinzas de punta fina Dumont # 5/45 para mantener el lugar de la cirugía abierta, avanzar en las puntas de las tijeras de primavera siguientes trayectoria del nervio, a continuación, mueva las pinzas dorsal para mantener el área recién abierta avanzada. </li><li> Visualice el tronco del nervio facial con el cigomático, bucal, y las ramas mandibulares marginales en este punto. NOTA: La rama temporal se encontrará más cerca del agujero. Las ramas del nervio mandibular marginal en sus partes superior e inferior más cerca de la mandíbula, por lo tanto aquellas ramas nerviosas no serán visibles en este nivel. <ol><li> Si se realiza un corte transversal del nervio, estabilizar el nervio suavemente con las pinzas de punta fina y cortar el nervio con las tijeras de primavera. Evite aplicar demasiada tracción en el nervio con las pinzas para evitar avulsing el nervio del tronco cerebral. Empujarlos tocones de distancia el uno del otro, o cortar y eliminar una porción del nervio distal para asegurar que no se produzca ninguna reconexión. </li><li> Si la realización de una lesión por aplastamiento, utilice Dumont # 5/45 pinzas para comprimir el nervio durante 30 segundos usando una presión constante para cortar todos los axones, repita este flechazo en un segundo ángulo perpendicular al primer sitio de aplastamiento. Evite aplicar cantidades variables de presión durante la aglomeración 30 segundos, de lo contrario el daño será inconsistente entre los animales. </li></ol></li></ol> 4. Cierre y Recuperación <ol><li> Vuelva a colocar la grasa y los músculos de las estructuras subyacentes. </li><li> Aproximar los bordes de la incisión y cerrar la herida usando un clip herida 7,5 mm. Las suturas o pegamento también son aceptables para el cierre de la herida. Analgésicos posquirúrgicas se pueden proporcionar en este momento. </li><li> Retire la cinta de la oreja del ratón. Apague el flujo isoflurano y permitir que el ratón para respirar oxígeno puro durante 30 segundos a 1 minuto. Place el ratón en una jaula vacía, sin ropa de cama para recuperarse de la anestesia. </li><li> Cuando se recupera el ratón, examine su comportamiento en busca de signos de confirmación de la parálisis facial. Los bigotes se paralizaron y en ángulo hacia la mejilla, la nariz se produce una desviación, y el ojo no parpadeará en respuesta a un soplo de aire. </li><li> Animales Casa en conjunto después de la cirugía si son de sexo femenino. Evite de ratones machos de forma conjunta, ya que son más agresivos y tienden a retirar por la fuerza clips de la herida de su cagemate, lo cual lleva a la infección. Proporcionar analgésicos posquirúrgicas en este momento, si es necesario. </li><li> Monitorear los ratones una vez al día durante varios días después de la operación para asegurarse de que no hay infección u otra complicación se produce después de la operación. Retire los clips de la herida 7-10 días después de la cirugía si no han caído por su propia cuenta. </li><li> Aplicar lubricante pomada ocular al ojo afectado diariamente para prevenir complicaciones de la córnea, o bien hasta que el reflejo del parpadeo del ojo es recubierta o hasta la eutanasia. </li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Los datos de resolución rendimientos pares de bases del protocolo presentado de metilación de citosina en regiones genómicas biológicamente relevantes. El protocolo escrito como está optimizado para 50 ng de material de partida, sin embargo, puede ser adaptada para manejar una amplia gama de material de entrada (5 ng o más) 26. Esto requerirá ajustes de algunos de los pasos del protocolo como se ve en la Tabla 6. Las bibliotecas ERRBS son susceptibles de secuenciación final emparejado y aún más la cobertura genómico también se puede lograr mediante secuenciación lee más de 51 ciclos. Secuenciación multiplexada ofrecerá un protocolo de menor costo por muestra, sin embargo, esto se traducirá en una cobertura reducida por sitio CpG representado en los datos (Figura 5 y Tabla 8), y no producir suficiente profundidad de cobertura para realizar análisis que requieren una alta cobertura por CpG sitio (por ejemplo, como se describe por Landan et al. 33). Por último, este protocolo (o cualquier protoco basada en bisulfitol) no puede distinguir entre metil-citosina y-hidroximetil citosina 46,47. Sin embargo, los datos generados se pueden integrar con otro protocolo de resultados 48,49 para delinear las diferentes modificaciones, y otras modificaciones de citosina recientemente reportaron 50, en caso de ser de su interés. Aparecerán bibliotecas de alta calidad, como se muestra en la Figura 3A-C, y una vez combinado para la secuenciación produce una traza como se muestra en la Figura 3G (trazo rojo) que representa contribuciones molares iguales de ambas fracciones de la biblioteca. Insuficiencia preparación de la biblioteca puede resultar de cualquier etapa durante el procedimiento. Si se procesa ADN degradado que se traducirá en las bibliotecas que no están enriquecidas en fragmentos MspI y por lo tanto en la cobertura bajo CpG utilizando los parámetros de secuenciación descritos en este protocolo. Si una enzima no es funcional o inadvertidamente excluidos de una de las reacciones, el protocolo no dió la biblioteca esperado. Si el rea ligaduracción es ineficiente, adaptadores están en una concentración mayor de lo esperado, y / o la concentración de cebadores usado es un reactivo limitante para los pasos de amplificación final, se puede producir el fracaso de la biblioteca. El exceso de adaptadores (visto como picos en ~ 150 pb en los resultados del bioanalizador; Figura 3D-F) en la biblioteca también interferirá con la secuenciación debido al agrupamiento indiscriminado de la biblioteca y el exceso de adaptadores. Mientras que tales una biblioteca puede secuenciar aparentemente normalmente, una porción significativa de la lee será secuencias meramente adaptador. Si se observan exceso de adaptadores en una biblioteca, lo mejor es repetir la preparación de la biblioteca si el material está disponible utilizando material de entrada óptima al adaptador proporciones cuantitativas. Finalmente, para asegurar la amplificación por PCR eficiente de las bibliotecas, las fracciones de la biblioteca inferiores y superiores se mantienen como muestras separadas a lo largo de la conversión de bisulfito y etapas de enriquecimiento de PCR. De no hacerlo, se obtiene la eficacia diferencial de amplificación durante la PCR reacción de fracciones superiores e inferiores (como se ve en la Figura 3G traza azul) y el potencial de representación desigual de la respectiva loci genómico cubierto en cada fracción de la biblioteca durante la secuenciación. El usuario puede optar por incluir un paso de PCR cuantitativa inmediatamente después de la conversión de bisulfito para su posterior titulación de ciclos de PCR óptimos necesarios para amplificar las bibliotecas se generan. ERRBS protocolo de preparación de biblioteca tiene varios pasos clave en el que se recomiendan reactivos específicos. En la etapa de reparación de extremo, el uso de una mezcla de dNTP de cuatro nucleótidos permite extremo reparación de cualquiera de los productos que no contienen el voladizo CG, tales como las resultantes de MspI actividad estrella enzimática y los fragmentos de ADN cortados presentes en la muestra de ADN original. Esto se traduce en una mejor representación CpG en los resultados. En la etapa de ligación es fundamental para utilizar una ligasa alta concentración (2.000.000 unidades / ml) y los adaptadores metilados para asegurar que el Reacti ligaduraen es eficiente y que la conversión de bisulfito no influye en las secuencias esenciales para la alineación de datos precisa de adaptador. En la etapa de PCR, usando una polimerasa capaz de amplificar fragmentos de ADN ricas en GC tratado con bisulfito es necesario para alta especificidad. Por último, para asegurar la eliminación del exceso de adaptadores y cebadores, purificación SPRI talón (por ejemplo: Agencourt AMPure XP) se recomienda en lugar de ensayos basados ​​en columnas para la ligadura y aislamientos de productos de PCR. Con el fin de generar datos de alta calidad, es importante para asegurar la conversión de bisulfito eficiente. El control presentado ofrece al usuario la capacidad de determinar la eficiencia de conversión antes de la secuenciación. Como alternativa, un ADN no humanos tales como ADN lambda se puede utilizar como un control interno (pico-in). Debido a las diferencias en las especies, este tipo de control puede incluirse directamente en la secuenciación de aguas abajo (por ejemplo, tal como se utiliza por Yu, et al. 34). Sin embargo, si el punto de I-ins utilizado, no puede ser utilizado para determinar la eficiencia de conversión antes de la secuenciación de la biblioteca amplificada a menos única e independientemente secuenciado antes de la secuenciación biblioteca. Los tipos de conversión determinados se basan en el estado de metilación en sitios no CpG. Esto puede no ser apropiado para el uso en el contexto de alta metilación de citosina en contexto no CpG (por ejemplo células madre embrionarias) y muestras paralelas o otros medios de evaluación de la eficiencia de conversión puede ser utilizado para este propósito. Hay algunas advertencias a la dirección que son exclusivos de la secuenciación de las bibliotecas ERRBS. Las tres primeras bases de las fracciones de la biblioteca secuenciados son casi uniformemente no aleatoria debido a la sitio de corte reconocimiento MspI (C ^ CGG; véase la Figura 4B, C). Esto resulta en la posibilidad de pérdida de datos importantes debido a la baja calidad lee resultante de una mala localización grupo a pesar de la aparente alta densidad racimo durante la secuenciación. Para superar esta barrera,incluir una biblioteca de alta complejidad en un carril independiente (control PhiX u otro tipo de biblioteca) como un carril de control dedicado. Bibliotecas de alta complejidad tienen extremos que contienen una representación equilibrada de A, C, T y G en los primeros cuatro bases secuenciadas. Carriles de control adecuados incluyen bibliotecas tales como ARN-ss, chip-ss, la secuenciación del genoma, o un control ofrecido por el fabricante de la máquina de secuenciación (por ejemplo v3 control PhiX). Cuando designado como un carril de control para la respectiva ejecución de secuenciación, puede servir como base para la generación de la matriz que se utiliza durante los primeros cuatro bases de secuenciación para detectar posiciones de racimo. La mayor calidad lee capturado elevará la cobertura media por CpG sitio por 5,2 (n = 4). Alternativamente, esta dificultad técnica también se puede superar utilizando un enfoque de secuenciación oscuro como se ha descrito previamente 23. Otros criterios de secuenciación siguen procedimientos operativos estándar por los protocolos del fabricante. Por último, la cobertura por CpG ccalzas para el análisis de datos será guiada por el usuario y, en parte, por las cuestiones biológicas de interés. Umbral de cobertura de 10x proporciona un enfoque de análisis de alta cobertura, sin embargo este umbral se puede bajar debería que ser de interés. Una discusión completa de análisis de datos ERRBS está más allá del alcance de este artículo, sin embargo, diferencialmente citosinas metiladas y regiones pueden determinarse utilizando herramientas de código abierto 31,51-53. Consideraciones de análisis adicionales y enfoques han sido bien descritos 54,55, y se anima al lector a buscar en la literatura para herramientas más adecuadas para el análisis planificado. En comparación con otros métodos publicados, ERRBS ofrece un protocolo de cuatro días que, cuando se lleva a cabo ya que los rendimientos descritos altas tasas de reproducibilidad. Se ha validado en comparación con el estándar de oro MassARRAY EpiTYPER 26 años, es rentable para datos de alta cobertura, y es adaptable a diversos materiales de entradacantidades (favorables para el procesamiento de muestras clínicas y otros tipos de células de baja frecuencia) y enfoques de secuenciación. Se ofrece una resolución de pares de bases en loci biológicamente relevante y se puede utilizar en los análisis de integración con otras técnicas de perfilado factor de transcripción de todo el genoma de unión, remodelación de la cromatina, marcas epigenéticas y otras modificaciones de citosina de interés. El uso de datos ERRBS en tales estudios puede contribuir a un enfoque molecular amplia y permitir para alta análisis dimensionales en el estudio de modelos biológicos y enfermedades humanas.

La metilación del ADN en citosina (5-metilcitosina) es una marca epigenética crítico en células de mamífero para una variedad de procesos biológicos, incluyendo, pero no limitado a la impresión, la inactivación del cromosoma X, el desarrollo, y la regulación de la expresión génica 1-8. El estudio de los patrones de metilación del ADN en los trastornos malignos y otros ha determinado los patrones específicos de la enfermedad y ha contribuido a la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y los posibles descubrimientos de biomarcadores 9-17. Hay muchos protocolos que interrogan el epigenoma de estado de metilación del ADN. Estos se pueden dividir en basado afinidad, la enzima de restricción-basan, y ensayos basados ​​conversión-bisulfito que utilizan microarrays o plataformas de secuenciación de aguas abajo. Además, hay algunos protocolos que unen estas categorías generales incluyendo, pero no limitado a, análisis de restricción combinado bisulfito de 18 y representación reducida bisulfito de secuenciación (RRB 19). </p&gt; RRB fue descrito originalmente por Meissner et al. 19,20. El protocolo introdujo un paso para enriquecer regiones genómicas ricas en GC, seguido por secuenciación de bisulfito, lo que resultó en datos de resolución de pares de bases cuantitativa que es rentable 21,22. Las regiones ricas en GC son el blanco de la enzima de restricción MspI (C ^ CGG), y la metilación de citosina se resuelve mediante la conversión de bisulfito de citosinas (desaminación de citosinas no modificados a uracilo), seguido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). RRB cubrieron la mayoría de los promotores de genes y las islas CpG en una fracción de la secuencia requerida para todo un genoma; sin embargo RRBs tenían cobertura limitada de costas CpG y otras regiones intergénicas de relevancia biológica. Varios grupos han publicado actualizado protocolos RRBs desde el informe original que mejorar en la metodología y cobertura resultante de estas regiones genómicas 23-25. Enhanced Representación reducido bisulfito Sequferencias (ERRBS) incluye modificaciones de preparación de biblioteca y una alineación de datos alternativa de aproximación 26 cuando se compara con los RRB. ERRBS resultó en un mayor número de CpG representadas en los datos generados y el aumento de la cobertura de todas las regiones genómicas interrogado 26. Este método ha sido utilizado para resolver los patrones de metilación del ADN en paciente humano y de otros especímenes de animales 26-30. El protocolo descrito ERRBS ofrece detalles sobre todos los pasos necesarios para la terminación y los datos se generó utilizando ADN humano representante (muestras se obtuvieron a partir de informes anteriores, las muestras de pacientes de-identificado 31, y una muestra de médula ósea CD34 + a partir de un donante humano normal). El protocolo incluye un proceso de selección de tamaño automático, lo que reduce el tiempo de procesamiento por muestra y permite una mayor precisión en la selección de tamaño de la biblioteca. El protocolo combina una serie de técnicas de biología molecular establecidas. ADN de alto peso molecular se digiere wITH una enzima de restricción insensible a metilación (MspI), seguido de la reparación final, A-tizón, y ligación de adaptadores metilados. Selección del tamaño de los fragmentos ricos en GC es seguido por la conversión de bisulfito y la amplificación PCR antes de la secuenciación. Conversión de bisulfito se ha descrito previamente 32 y revisión detallada de análisis y aplicaciones de datos está más allá del alcance de este trabajo, sin embargo se incluyen recomendaciones y referencias para el uso de los lectores. El protocolo se puede realizar en cuatro días y es susceptible de pequeña entrada (50 ng o menos) las cantidades de material. El protocolo ya que los rendimientos descritos de datos con alta cobertura por sitio CpG suficiente no sólo para las determinaciones diferenciales sitio de metilación y la región, sino también para la detección de polimorfismo epigenética como se describe por Landan, et al. 33.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:497px;">URL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">MspI</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">R0106M</td>
			<td style="width:193px;">100,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/r0106-mspi</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">NEBuffer 2</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B7002S</td>
			<td style="width:193px;">Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:269px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P4557</td>
			<td style="width:193px;">Equilibrated with 10&#160;mM Tris HCl, pH&#160;8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C2432</td>
			<td style="width:193px;">See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Glycogen</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">G1767</td>
			<td style="width:193px;">19-22 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">NaOAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td style="width:193px;">3M pH 5.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E7023</td>
			<td style="width:193px;">200 proof, for molecular biology</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Buffer EB</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">19086</td>
			<td style="width:193px;">10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T1503</td>
			<td style="width:193px;">prepare a 1M pH 8.5 solution</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T9285</td>
			<td style="width:193px;">Dilute to 1X buffer solution per manufacturer&#39;s recommendations</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B0202S</td>
			<td style="width:193px;">10X concentration</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">N0447L</td>
			<td style="width:193px;">10 mM each nucleotide</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0203L</td>
			<td style="width:193px;">3,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0210L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0201L</td>
			<td style="width:193px;">10,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28104</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 2.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;-deoxyadenosine 5&#39;-triphosphate (dATP)</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">U1201</td>
			<td style="width:193px;">100 mM</td>
			<td style="width:497px;">http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0212L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28004</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 3.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202M</td>
			<td style="width:193px;">2,000,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Methylation Adapter Oligo Kit</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td style="width:104px;">ME-100-0010</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:269px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:153px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63881</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use</td>
			<td style="width:497px;">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td style="width:104px;">CDF2010</td>
			<td style="width:193px;">with internal standards</td>
			<td style="width:497px;">http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Certified Low Range Ultra Agarose</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-3106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4415</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:193px;">10 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Loading Dye, Orange (6X)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7022S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpel&#160;Blade&#160;No.&#160;11</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&#38;tab=Items&#38;productId=11876776</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5001</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5030</td>
			<td style="width:193px;">Alternative for step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">Universal Methylated Human DNA Standard</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td>D5011</td>
			<td style="width:193px;">Used as bisulfite conversion control</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">FastStart High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">03553426001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:269px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:193px;">A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1</td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:104px;">5067-4626</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&#38;tabId=AG-PR-1069</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&#38;tabId=AG-PR-1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pippin Prep</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>GD-401-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq SBS Kit v3-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-401-3002</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">TruSeq RNA Sample prep</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td style="width:193px;">Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol</td>
			<td style="width:497px;">http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Block Heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Electrophoresis power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel doc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">UV or blue light transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution

ADN mapeo patrón de metilación se estudia en gran medida en los tejidos normales y enfermos. Una variedad de métodos se han establecido para interrogar a los patrones de metilación de citosina en las células. Representación reducida de toda la secuenciación del genoma de bisulfito fue desarrollado para detectar pares de bases patrones de metilación de citosina resolución cuantitativos en loci genómica GC-ricos. Esto se logra mediante la combinación del uso de una enzima de restricción seguido por la conversión de bisulfito. Enhanced representación reducida bisulfito de secuenciación (ERRBS) aumenta el loci genómico biológicamente relevante cubierto y se ha utilizado para perfil de metilación de citosina en el ADN de humano, ratón y otros organismos. ERRBS inicia con la restricción de la digestión enzimática de ADN para generar fragmentos de bajo peso molecular para uso en la preparación de la biblioteca. Estos fragmentos se someten a la construcción de bibliotecas estándar para la secuenciación de próxima generación. Bisulfito de conversión de citosinas no metiladas antes de la última amplificatide paso permite la resolución de base cuantitativa de los niveles de metilación de citosina en loci genómicos cubierto. El protocolo puede ser completada dentro de cuatro días. A pesar de baja complejidad en los primeros tres bases secuenciadas, bibliotecas ERRBS producen datos de alta calidad cuando se utiliza un carril de control de secuencia designada. Análisis de la cartografía y la bioinformática se realiza entonces y produce datos que se puede integrar fácilmente con una variedad de plataformas en todo el genoma. ERRBS puede utilizar pequeñas cantidades de material de entrada por lo que es factible para procesar las muestras clínicas humanas y aplicable en una amplia gama de aplicaciones de investigación. El video producido demuestra los pasos críticos del protocolo ERRBS.

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Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K vistas.  Weill Cornell Medical College. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Video: Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Investigación

Biología

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reducción de gravedad Demostraciones entorno de hardware de un prototipo miniaturizado citómetro de flujo y Compañero Microfluidos Tecnología de mezcla

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

La correlación de Gene-específica de ADN de metilación cambios con la expresión y actividad transcripcional de astrocíticos<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

El Método chip-exo: La identificación de las interacciones proteína-ADN con zona de Base Par de precisión

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...