Este video muestra cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares derivadas de tumores, o EV, utilizando citometría de flujo. El método de detección descrito en este documento es relativamente fácil de realizar y se puede adaptar a varios entornos. En cáncer, la identificación de condiciones de vesícula extracelular inmunogénica libera de particular relevancia traslacional.
Como tal, los EV autólogos podrían usarse como tratamientos personalizados contra el cáncer. Demostrando la primera parte del procedimiento estará Tatiana Nedelko, una asistente técnica de mi laboratorio. Para comenzar la preparación de los medios de cultivo celular necesarios para la vesícula extracelular, o EV, agote los EV bovinos en medios FCS mediante ultracentrifugación a 100, 000 veces g durante 24 horas a 4 grados Celsius.
Deseche el pellet después de la centrifugación. Cosechar las células murinas de melanoma B16 que expresan ovoalbúmina, o células B16-OVA, del cultivo y lavar las células dos veces con PBS. Luego, sembra las células a una concentración de 400, 000 células por mililitro en el medio agotado de EV.
A continuación, trate las células B16-OVA con 30 microgramos de oxaliplatino por mililitro e incube durante 24 horas a 37 grados centígrados con muestras de control no tratadas. Después de 24 horas, recoja el sobrenadante para centrifugar a 400 veces g durante cinco minutos a 4 grados centígrados. Deseche el pellet antes de centrifugarlo de nuevo a 2.000 veces g durante 30 minutos a 4 grados centígrados.
Después de desechar el pellet, filtre el sobrenadante a través de un filtro de membrana de PVDF de 220 nanómetros en un tubo fresco. Luego, mezcle 1 mililitro de sobrenadante con 0.5 mililitros de un reactivo de aislamiento de exosomas específico disponible comercialmente. Vórtice y transfiera la mezcla a tubos de 1,5 mililitros, seguido de una incubación nocturna a 4 grados centígrados.
Al día siguiente, centrifugar la mezcla a 10, 000 veces g durante 60 minutos a 4 grados centígrados. Después de desechar cuidadosamente el sobrenadante, retire las gotas restantes golpeando el tubo de 1,5 mililitros boca abajo en una toalla de papel y por aspiración a través de una punta fina de pipeta sin tocar el pellet EV en la parte inferior. Vuelva a suspender el pellet en PBS frío pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin rayar el pellet con la punta.
Luego, agrupe los vehículos eléctricos de todos los tubos. Si no se usa inmediatamente, guarde las suspensiones EV a 80 grados Celsius en recipientes siliconados durante un máximo de 28 días hasta la aplicación. Para inmunizar a cada ratón en el grupo de tratamiento con EV aislados de 4.0 x 10 a la quinta célula B16-OVA, mezcle 5 microlitros de la suspensión EV con 55 microlitros de PBS frío.
A continuación, llene las jeringas montadas con agujas de calibre 26 a 30 con 60 microlitros de los EV diluidos o PBS y luego coloque inmediatamente la jeringa en hielo. Inocular los EV o PBS por vía subcutánea en el aspecto medial del muslo de los ratones. Repita la inmunización después de siete días.
14 días después del primer tratamiento, sacrifique a los ratones para resecar el bazo. Luego, triture el bazo resecado con un colador celular humedecido de 100 micrómetros y el émbolo de plástico de una jeringa. Enjuague las células esplénicas en un tubo de 50 mililitros con 5 a 10 mililitros del RPMI completo y frío.
A continuación, centrifugue las células a 400 veces g durante cinco minutos a 4 grados centígrados antes de desechar el sobrenadante. Para eliminar los eritrocitos de la suspensión celular, resuspenda e incubar el pellet celular con 2 mililitros del tampón de lisis de glóbulos rojos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, detenga la reacción agregando de cinco a 10 mililitros de RPMI completo, seguido de centrifugación como se describió anteriormente.
Después de resuspender el pellet celular en RPMI completo, cuente las células de cada ratón y coloque los triplicados de 200, 000 esplenocitos con 200 microlitros de cRPMI en cada pozo de una placa de 96 pocillos con un fondo en forma de U. Luego, incuba las placas durante 48 horas a 37 grados centígrados. Después de 48 horas, trate el cultivo celular con 5 nanogramos por mililitro brefeldina A, 20 nanogramos por mililitro PMA y 1 microgramo por mililitro de ionomicina a 37 grados Celsius durante 4 horas.
Después de la incubación, transfiera los esplenocitos a una placa de 96 pocillos con un fondo en forma de V y lave las células dos veces con PBS. Resuspend los esplenocitos granulados en la solución de tinción recién preparada e incubar la suspensión celular durante 30 minutos a 4 grados centígrados protegido de la luz. Para la fijación y permeabilización, lave los esplenocitos dos veces en el tampón FACS y luego resuspenda los esplenocitos en 100 microlitros por pozo de la solución de fijación y permeabilización, seguido de incubación en la oscuridad como se explicó anteriormente.
Para teñir el interferón gamma intracelular, lave los esplenocitos en el tampón de fijación o permeabilización antes de reenviar las células con los anticuerpos fluorescentes contra el interferón gamma diluido 1:200 en el tampón. Incubar los esplenocitos durante 1 a 12 horas a 4 grados centígrados en la oscuridad. Después de un lavado y resuspensión exhaustivos en FACS-buffer, analizar la activación de las células T citotóxicas de acuerdo con la estrategia de gating explicada en el manuscrito.
En la imagen representativa, se muestra la estrategia de gating para analizar la activación de las células T citotóxicas. Las células fueron cerradas como las células individuales, el subconjunto de linfocitos, las células T CD3 positivas viables y las células T citotóxicas CD8 positivas CD4 negativas. La acumulación intracelular del interferón gamma se evaluó como un marcador sustituto para la activación.
Después de la inmunización con EV derivados de las células tumorales, se estudió la inducción de respuestas de células T específicas de antígeno en ratones receptores. Los EV derivados del tumor cultivados en condiciones de estrés genotóxico, como el tratamiento con oxaliplatino, indujeron una potente activación de las células T citotóxicas esplénicas en contraste con los EV no tratados. El grupo de animales tratados con vehículos mostró la respuesta más baja.
La activación de las células T esplénicas se determinó después de la reestimulación ex vivo, ya sea en presencia o ausencia de ovoalbúmina. La producción del interferón gamma se incrementó cuando los esplenocitos de los animales tratados con EV tumoral se reestimularon con el antígeno tumoral modelo ovalbúmina antes del análisis. Tenga en cuenta que los resultados reproducibles dependen de la eficacia de aislamiento constante de los vehículos eléctricos.
Por lo tanto, asegúrese de que los gránulos EV se resuspendan por completo y con prontitud para evitar la desecación. Con este protocolo, pudimos analizar vías específicas dentro de las células tumorales que determinan la inmunogenicidad de los EV derivados de células tumorales. Esto puede allanar el camino para aprovechar tales EV inmunogénicos en el tratamiento del cáncer.
