Este método se puede utilizar para asses cómo nuevos agentes terapéuticos o estrategias, influir o aumentar la respuesta de los linfocitos T citotóxicos durante el cáncer de páncreas. Esta técnica permite que los tumores se digieren y estimulen rápidamente in vitro, permitiendo el análisis de múltiples parámetros de la respuesta de la célula T simultáneamente, que se pueden adaptar fácilmente para otras aplicaciones. Para empezar, usa fórceps, transfiere el tumor a una placa de petri.
Almacene cinco mililitros de medio de digestión en un tubo de 50 mililitros sobre hielo para evitar que la actividad enzimática se amencie. Tome una pequeña alícuota de esta solución, para cubrir el tumor en el plato petri. Usa un bisturí estéril y fórceps para cortar el tumor en trozos pequeños, de aproximadamente menos de tres milímetros de longitud.
Raspa las piezas del tumor en el tubo e invierte suavemente el tubo hasta que todas las piezas estén sumergidas en los medios de digestión. Transfiera el tubo a un dispositivo de agitación durante 20 minutos a 37 grados centígrados para digerir. Asegúrese de que todos los trozos de tumor estén sumergidos y no pegados al borde del tubo.
Inmediatamente después del paso de digestión, coloque el tubo sobre hielo para ralentizar la actividad enzimática. Añadir EDTA para lograr una concentración final de 20 milimolar, y vórtice brevemente la muestra a mezclar con el fin de ralentizar aún más la actividad enzimática. Abra el tubo y enjuague cualquier tumor digiere la tapa del tubo con un medio RPMI fresco.
A continuación, prepare un colador de 70 micras, colóquelo en un tubo abierto de 50 mililitros sobre hielo. Pre-humedece el filtro con medio. Resuspender las células digeridas y lavar los lados del tubo usando un Stripette de 25 mililitros o más grande.
La apertura más ancha de la Stripette permite que el digerido grueso pase fácilmente. Transfiera todo el digerido al colador, usando el Stripette de 25 mililitros. Machacar hacia arriba y hacia abajo el tumor en la parte superior del filtro usando un émbolo de jeringa de un mililitro.
Lave continuamente las células a través del colador con RPMI. Asegúrese de lavar con suficiente fuerza para empujar las células a través. Continúe lavando hasta que todas las células hayan pasado a través del colador.
Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 300 veces G, y cuatro grados Celsius. Resuspender cuidadosamente el pellet celular, y completar la RPMI, y pasar directamente a través de otro filtro para eliminar cualquier matriz extracelular, o grumos de células grandes que no se pueden resuspender adecuadamente. Si no se requiere estimulación, manche inmediatamente las células aisladas para el análisis de citometría de flujo, o resuspenderlas en medio de congelación de 10%DMSO y FBS, y almacenar en menos 80 grados Celsius.
Para realizar la estimulación, primero cuente las células. Diluir las células en medio completo para lograr una concentración de dos veces diez a seis por cada 100 microlitros. Placa 100 microlitros de células en cada pozo de una placa de 96 pozos con fondo en U.
Añadir 100 microlitros de medio completo, que contienen una preparación 2X de PMA, e Ionomicina. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados, pero 5% de dióxido de carbono durante una hora. Luego, a 20 microlitros de una preparación 10X de Brefeldin A, y Monensin, y medios completos para lograr una concentración final de 1,06 micromolares, y 2,0 micromolares, respectivamente.
Vuelva a colocar el plato en la incubadora durante otras cuatro horas. Después de inyectar 1000 TB32048 células en el páncreas, los tumores ortotópicos tardan aproximadamente 30 días en desarrollarse. Después de la digestión y estimulación de los tumores ortotópicos cosechados, se realizó una fluorescencia menos una para determinar la fluorescencia de fondo para el gating.
Y Brefeldin A Monensin sólo se realizó el control para determinar la producción basal de citoquinas. Para la incubación de interferón-gamma con Brefeldin A y Monensin, no se produce ningún aumento en la gamma de interferón sobre el control de la MOF, tanto en muestras de bazo como de tumores. Sin embargo, la adición de PMA e ionomicina, aumentó el porcentaje de gamma de interferón intracelular detectable en células T positivas CD4 y CD8 derivadas de tumores y esplénicas.
Los células T positivas CD4 esplénicas y CD8 positivas, utilizadas como control positivo, tienen una producción gamma de interferón relativamente mayor, que los subconjuntos de células T que se infiltran en tumores. Indicando que la inmunosupresión ocurre dentro del tumor. Utilizando la misma estrategia para TNF alfa, un alto porcentaje de células T positivas CD4 esplénicas fueron positivas para el alfa TNF intracelular.
En comparación con las células T positivas CD4 infiltrantes de tumores. Células T POSITIVAs CD8 esplénicas e infiltrantes de tumores, produjeron niveles similares de TNF alfa. Asegúrese de que el tumor esté suficientemente picado y de que todas las piezas estén sumergidas en medios de digestión.
Al machacar el tumor, asegúrese de ser suave y lavar las células a fondo. El protocolo de digestión tumoral se puede combinar con la clasificación celular asistida por flujo, para purificar subconjuntos de células inmunitarias individuales para análisis adicionales, funcionales o de expresión génica. Hemos utilizado este método para caracterizar cómo las células B dan forma a la respuesta inmune durante el cáncer de páncreas, generando tumores ortotópicos en ratones con nocaut de células B y B agotadas.
