En este protocolo JoVE, utilizamos la secuenciación de ARN de un solo núcleo basada en gotas para caracterizar la arquitectura biológica de las neuronas simpáticas cardíacas en la salud y la enfermedad. Este método permite la secuenciación de una gran colección de muestras neuronales durante un período de tiempo. Al tirar de núcleos con código de barras con hashtag oligos, este método permite la multiplexación de las muestras.
Este método tiene el potencial de extenderse a la secuenciación de neuronas de los ganglios humanos, lo que ha sido un desafío debido a su gran tamaño celular y la difícil recolección simultánea de muestras. Demostrando el procedimiento estarán Conny van Munsteren, técnico de investigación, y Lieke van Roon, estudiantes de doctorado de nuestro laboratorio Comience recolectando todos los materiales necesarios para la disección, luego fije el ratón en el tablero de disección. Humedezca el ratón con 70% de etanol para minimizar la dispersión del pelaje.
Abra la piel de la región del cuello haciendo un corte de línea media con tijeras. Bajo un microscopio estereoscópico, mueva las glándulas submandibulares a un lado y retire el músculo mastoideo esternal para exponer la arteria carótida común y su bifurcación, así como los ganglios cervicales superiores y elimine el tejido unido a ella. Diseccionar la bifurcación de la arteria carótida derecha e izquierda y el tejido adherido a ella.
Transfiera cada pieza diseccionada de tejido a una placa de Petri separada de 3,5 centímetros que contenga PBS frío. Localice los ganglios cervicales superiores unidos a la bifurcación carotídea. Limpie los ganglios cervicales superiores extirpando la arteria y el tejido adherido.
Para diseccionar los ganglios estrellados, haga un corte de la línea media en el abdomen, seguido de abrir el diafragma y la pared torácica ventral. Extirpar los pulmones, seguido del corazón, para exponer el tórax dorsal. A nivel de la primera costilla, localice los ganglios estrellados izquierdo y derecho anterolateral al musculus colli longus.
Diseccionar ambos ganglios estrellados con fórceps mediante la eliminación del tejido circundante. Transfiéralos a placas de Petri de 3,5 centímetros que contengan PBS frío. Usando fórceps, transfiera los ganglios cervicales superiores y los ganglios estrellados para separar los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y luego agregue 500 microlitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a cada tubo e incube en un baño de agua agitada.
Permita que los ganglios se asienten en la parte inferior de los tubos de la microcentrífuga. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medio ganglionar. A los tubos de la microcentrífuga, agregue 500 microlitros de solución de colagenasa tipo 2 e incube en un baño de agua agitada.
Después de la incubación, vuelva a suspender los ganglios en solución de colagenasa mediante pipeteo hasta que ya no se detecten grupos de tejido. Transfiera la suspensión celular al tubo de 15 mililitros utilizado anteriormente que contiene el medio de cultivo de ganglios con suspensión de tripsina-EDTA. Centrifugar la suspensión celular y desechar el sobrenadante celular.
Resuspend el pellet en 270 microlitros de suero fetal bovino y transfiéralo a un criovial de 1 mililitro. Para contar las células, mezcle 5 microlitros de la suspensión celular ganglionar con cinco microlitros de colorante azul tripano al 0,4%. Cargue la mezcla en un hemocitómetro y cuente el número total y de células vivas bajo un microscopio.
A continuación, agregue 30 microlitros de dimetilsulfóxido a cada criovial y mezcle bien. Transfiera los crioviales a un recipiente de congelación celular y colóquelo a menos 80 grados centígrados durante la noche. Prepare tubos de 15 mililitros con un colador de 30 micrómetros en la parte superior.
Enjuague previamente el colador con 1 mililitro de medio ganglionar. Saque los crioviales del nitrógeno líquido e inmediatamente descongelarlos en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta que quede una pequeña bolita de hielo en el criovial. Agregue 1 mililitro del medio ganglionar en cada criovial mientras agita cuidadosamente el vial para recuperar las células ganglionares.
Cargue la suspensión de células ganglionares en el colador y enjuague con 4 a 5 mililitros de medio ganglionar. Centrifugar la suspensión celular tensa. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 50 microlitros de tampón de lavado celular.
Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de baja unión de 0,5 mililitros. Centrifugar la suspensión celular. Una centrífuga con un rotor de cucharón oscilante es esencial a partir de ahora.
Después de la centrifugación, retire 45 microlitros del sobrenadante sin desalojar la bolita celular. Agregue 45 microlitros de tampón de lisis refrigerado, mezclado suavemente por pipeteo, e incube las células durante 8 minutos en hielo, luego agregue 50 microlitros de tampón de lavado de núcleos fríos a cada tubo. Centrifugar la suspensión de núcleos y retirar 95 microlitros del sobrenadante sin interrumpir el pellet de núcleos.
Agregue 45 microlitros de tampón de lavado de núcleos refrigerados al pellet, repita la centrifugación y retire el sobrenadante. Al núcleo pellet, agregue 50 microlitros de ST-SB y pipetee suavemente hasta que los núcleos estén completamente resuspendidos, luego agregue 5 microlitros de reactivo de bloqueo FC e incube durante 10 minutos en hielo. A continuación, agregue 1 microlitro de anticuerpo hashtag de un solo núcleo e incube durante 30 minutos en hielo.
Después de la incubación, agregue 100 microlitros de ST-SB a cada tubo. Centrifugar la suspensión y retirar 145 microlitros del sobrenadante sin interrumpir el pellet de núcleos. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante.
Resuspend los núcleos pellet en 50 microlitros de ST-SB y mezclar suavemente. Tome 5 microlitros de la suspensión de núcleos y mézclelo con 5 microlitros de azul de tripano al 0,4% para contar los núcleos bajo un microscopio. Una vez más, centrifugue la suspensión de núcleos y resuspenda el pellet de núcleos en ST-SB para lograr una concentración de núcleos objetivo de 1, 000 a 3, 000 núcleos por microlitro.
Tire de las muestras para lograr el número deseado de células. El análisis de control de calidad para la preparación de la biblioteca mostró cDNA oligoderivados de hashtag menores que 180 pares de bases. Un pico amplio de 300 a 1,000 pares de bases representó una biblioteca de expresión génica de alta calidad, mientras que un pico específico de 194 pares de bases mostró la biblioteca de oligo hashtag.
El análisis de secuenciación de ARN de un solo núcleo reveló que 12 grupos que fueron visualizados por UMAP y los anticuerpos hashtag se distribuyeron entre todos los grupos. El etiquetado específico por hashtag oligos fue confirmado por la expresión de Xist. Los hashtags 1 a 4 etiquetaron a las mujeres, mientras que de 5 a 8 etiquetaron a las muestras masculinas.
La calidad y la resolución de los datos de secuenciación se verificaron mediante transcripciones clave como TH, DBH y SNAP25 en los grupos 5 y 7 para las neuronas simpáticas, S100B en los grupos 0 a 3 para las células gliales satélite, PECAM 1 en el grupo 4 para las células endoteliales y ACTA2 en el grupo 8 para las células estromales. Al intentar este método, es importante recordar la preparación adecuada y el equipo adecuado, como tijeras de disección fina, pinzas afiladas y una centrífuga con un rotor de cucharón oscilante son esenciales. El enfoque gradual para la secuenciación de ARN de un solo núcleo de ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos tiene el potencial de una amplia aplicación en la caracterización de los ganglios que inervan otros órganos y tejidos relacionados en la salud y la enfermedad.
