La secuenciación de nanoporos de tercera generación es una potente y novedosa tecnología de secuenciación que permite obtener muy fácilmente información de secuencia de una amplia variedad de muestras. Las principales ventajas de esta técnica son la portabilidad del dispositivo de secuenciación, la longitud de lectura extremadamente larga y la disponibilidad en tiempo real de los datos. La secuenciación de nanoporos es una tecnología particularmente útil durante los brotes de enfermedades en lugares remotos.
Se ha utilizado con éxito en laboratorios de campo durante y después de los brotes del virus del Ebola en el oeste y centro de Africa. A través de la secuenciación de nanosporas y el uso del dispositivo MinION para este propósito es bastante fácil, se debe tener cuidado durante la preparación de la biblioteca y durante la carga de la celda de flujo. Para comenzar este procedimiento, configure un PCR de touchdown para amplificar el ADNm con un conjunto de imprimación utilizando una polimerasa de ADN de alta fidelidad de inicio en caliente con el búfer de reacción adecuado en un volumen de reacción de 50 microlitios con una plantilla de microlitro.
Si es posible, configure la reacción sobre hielo o en un bloque frío a cuatro grados centígrados. Incubar la reacción en un termociclador como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, transfiera 50 microlitros del producto PCR a un tubo de reacción de baja unión de ADN de 1,5 mililitros.
Resuspender las cuentas magnéticas a fondo por vórtice. A continuación, añadir 50 microlitros de perlas a la reacción PCR y mezclar bien. Incubar la muestra en un mezclador giratorio durante cinco minutos a temperatura ambiente mientras gira a 15 RPM.
Gire brevemente la muestra y luego coloque el tubo en un bastidor magnético para peletizar las cuentas magnéticas. Espere hasta que el sobrenadante se haya aclarado por completo antes de continuar. A continuación, aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet de cordón y desecharlo.
Pipetear 200 microlitros de 70% etanol en el tubo de reacción e incubar durante 30 segundos a temperatura ambiente. Aspirar el etanol sin alterar el pellet de cordón y desecharlo. Repita este proceso de lavado con etanol una vez más para un total de dos lavados.
Seque el pellet al aire durante un minuto a temperatura ambiente. A continuación, retire el tubo de reacción del bastidor magnético. Resuspender el pellet en 30 microlitros de agua libre de nucleasas e incubar a temperatura ambiente durante dos minutos.
Coloque el tubo de reacción de nuevo en el bastidor magnético y espere hasta que las perlas de reacción estén completamente peletadas. Después de esto, retire el sobrenadante sin alterar el pellet y transfiera a un nuevo tubo de reacción de 1,5 mililitros. Si se van a secuenciar varias muestras al mismo tiempo, ahora se pueden agregar códigos de barras mediante dos pasos adicionales de PCR seguidos de la limpieza de ADN como se ha mostrado anteriormente.
En primer lugar, combinar una cantidad igual de ADN con código de barras de cada muestra para un total de un microgramo de ADN en un volumen de 45 microlitros en un tubo de reacción de 0,2 mililitros. Para dA-Tailing, agregue siete microlitros de tampón de reacción de preparación final, tres microlitros de mezcla de enzimas de preparación final y cinco microlitros de agua libre de nucleasa. Deslice suavemente el tubo para mezclar.
En un termociclador, incubar la reacción durante cinco minutos a 20 grados centígrados seguidos de cinco minutos a 65 grados centígrados. A continuación, realice la purificación PCR del producto de reacción como se describe en el protocolo de texto. Opcionalmente, tome un microlitro para cuantificar la concentración de la muestra utilizando un espectrofotómetro UV.
Combine 22,5 microlitros del ADN purificado obtenido previamente con 2,5 microlitros de adaptador 1D2 y 25 microlitros de Blunt/TA Ligase Master Mix en un nuevo tubo de reacción de baja unión de ADN de 1,5 mililitros. Deslice suavemente el tubo para mezclar. Gire brevemente la mezcla e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
A continuación, realice la purificación PCR del producto de reacción como se describe en el protocolo de texto. Combine 45 microlitros del producto de reacción con cinco microlitros de mezcla de adaptador de código de barras y 50 microlitros de Blunt/TA Ligase Master Mix en un tubo de reacción de baja unión de ADN. Deslice suavemente para mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Purifique el producto de reacción como se describe en el protocolo de texto y almacene el producto resultante en hielo o a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar. Para comenzar, realice una comprobación de calidad en la celda de flujo antes de su uso. Para ello, conecte el dispositivo de secuenciación al equipo host y abra el software.
Inserte una celda de flujo en el dispositivo de secuenciación. A continuación, elija el tipo de celda de flujo en el cuadro selector y haga clic en disponible para confirmar. En la parte inferior de la pantalla, haga clic en comprobar celda de flujo y elija el tipo de celda de flujo correcto.
Haga clic en Iniciar prueba para iniciar la comprobación de calidad. Se requiere un mínimo de 800 nanoporos activos en total para que la celda de flujo sea utilizable. En primer lugar, abra la cubierta del puerto de cebado deslizándola en el sentido de las agujas del reloj.
Ajuste una pipeta P1000 en 200 microlitros e inserte la punta en el puerto de cebado. A continuación, ajuste la pipeta a 230 microlitros mientras mantiene la punta en el puerto de cebado para extraer de 20 a 30 microlitros de tampón y eliminar cualquier burbuja de aire. En un nuevo tubo de reacción de baja unión de ADN de 1,5 mililitros, prepare la mezcla de cebado combinando 576 microlitros de tampón RBF con 624 microlitros de agua libre de nucleasa.
Pipetear cuidadosamente 800 microlitros de la mezcla de cebado preparada en el puerto de cebado y esperar cinco minutos. Después de esto, levante la cubierta del puerto de muestra y pipetee 200 microlitros adicionales de la mezcla de cebado preparada en el puerto de cebado. Pipetear 35 microlitros del tampón RBF en un nuevo tubo de reacción de baja unión de ADN de 1,5 mililitros limpio.
Mezcle bien las perlas LLB pipeteando y agregue 25,5 microlitros de las perlas al búfer RBF. A continuación, agregue 2,5 microlitros de agua libre de nucleasas y 12 microlitros de la biblioteca de ADN y mezcle por pipeteo. Agregue 75 microlitros de la mezcla de muestra de forma lenta a la celda de flujo a través del puerto de muestra.
A continuación, reemplace la cubierta del puerto de muestra, cierre el puerto de cebado y cierre la tapa del dispositivo de secuenciación. Dentro del software, confirme que la celda de flujo todavía está disponible. Abra un nuevo experimento y configure los parámetros de ejecución seleccionando el kit utilizado.
Seleccione el invocación base en vivo. Inicie la ejecución de secuenciación haciendo clic en Iniciar experimento. Continúe la ejecución de secuenciación hasta que se recopilen suficientes datos experimentales.
En un experimento representativo, el ARN se extrae de 10 muestras de sangre diferentes de cinco especies animales. Las concentraciones de ARN se observan entre 43 nanogramos y 543 nanogramos por microlitro. Después de la amplificación por RT-PCR, el análisis en gel de los productos MPC1 PCR muestra varios resultados con bandas marcadamente más débiles para las muestras BC01 y BC02.
Estas diferencias son probablemente causadas por diferencias en la calidad de la muestra, aunque no se pueden excluir las diferencias en la eficacia de la PCR debido a diferencias en la unión de imprimación al gen MCP1 de diferentes especies. Sin embargo, estas diferencias en el rendimiento y/o la eficiencia de amplificación no afectan notablemente el resultado de la secuenciación general. A continuación, se selecciona y desmultiplexa un subconjunto de 10.000 lecturas obtenidas para su posterior análisis.
De las 10.000 lecturas analizadas, 5, 457 muestran una longitud entre 1, 750 y 2.000 nucleótidos que coincide con los tamaños esperados para los fragmentos de PCR amplificados como parte de nuestro flujo de trabajo. Se observa un pico adicional en la distribución de la longitud de las lecturas entre 250 y 500 nucleótidos que pueden atribuirse a productos de PCR inespecíficos. La desmultiplexación de lecturas permite la asignación del 87,6% de las lecturas a una de las 10 muestras analizadas.
Si bien este método es bastante fiable, en condiciones de campo, la amplificación de PCR es el paso más problemático. Durante nuestras experiencias, los protocolos anidados a menudo eran necesarios para amplificar las secuencias de destino. Además de secuenciar genes host animales, este método también se puede utilizar para secuenciar cualquier ADN o ARN, incluidos patógenos virales o bacterianos.
Por lo tanto, la secuenciación de nanopore se utiliza cada vez más no sólo durante los brotes de enfermedades o para estudios científicos en lugares remotos, sino también en laboratorios regulares donde las largas longitudes de lectura abren nuevas y emocionantes posibilidades de investigación. Si bien ninguno de los reactivos utilizados es particularmente peligroso, se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio estándar. Obviamente, al secuenciar agentes de la enfermedad, se deben observar todas las precauciones necesarias para el manejo de estos agentes.
