Con TRAP-seq, podemos aislar el ARN de tipos celulares específicos, como los hepatocitos que repoblan en el hígado lesionado para analizar los cambios de expresión génica que ocurren en esas células. No requiere ningún paso para eliminar las células no deseadas del tejido. El ARN específico del tipo de célula se aísla mediante la purificación de afinidad a partir de lisatos de órganos enteros.
Esta técnica nos ayuda a determinar cómo responden las células específicas a las lesiones, lo que podría ayudar a identificar nuevas estrategias o medicamentos para combatir la enfermedad hepática. Esto podría ser utilizado para identificar cómo las células hepáticas responden a diferentes tipos de lesiones hepáticas. Actualmente, hay pocas opciones para lesiones hepáticas agudas graves y este método nos ayudará a inslizarnos en nuevos tratamientos.
Este método se originó en el cerebro. En el hígado, imaginamos que podría ser utilizado para examinar los cambios dinámicos en una variedad de tipos de células, los hepatocitos, células del conducto biliar, células Kupffer, y células endoteliales, por nombrar algunos. Demostrando el procedimiento estará Amber Wang, una estudiante graduada y mi estudiante.
Para empezar, resuspender las cuentas magnéticas por pipeteo suave. Recoger las perlas en un soporte magnético durante más de un minuto y quitar el sobrenadante. A continuación, retire el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y agregue un mililitro de PBS, seguido de pipetear hacia arriba y hacia abajo para lavar las perlas.
Coloque el tubo de nuevo en el soporte magnético durante más de un minuto para recoger las perlas y quitar el PBS. Para preparar cuentas recubiertas de proteína L, agregue 16 microlitros de proteína biotinilada L a las perlas magnéticas resuspendidas y lavadas y agregue 1X PBS para hacer el volumen final de un mililitro, si utiliza un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, o 1,5 litros, si utiliza un tubo de microcentrífo de dos mililitros. Incubar las cuentas magnéticas con proteína biotinilada L durante 35 minutos a temperatura ambiente en un rotador de tubo.
A continuación, coloque el tubo en el soporte magnético durante más de un minuto y retire el sobrenadante para recoger las perlas recubiertas de proteína L. Retire el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y añada un mililitro de PBS con un tampón 3%BSA, seguido de pipeteo suave al menos cinco veces para lavar las cuentas recubiertas de L de proteína. Una vez más, coloque el tubo en el soporte magnético durante más de un minuto y retire el sobrenadante para recoger las perlas recubiertas.
Repita el lavado de la BSA otras cuatro veces. A continuación, añada 50 microgramos de anticuerpos para el anticuerpo GFP 19C8 y el anticuerpo GFP 19F7 cada uno en las cuentas recubiertas de L de proteína, e incubar durante una hora a cuatro grados Celsius en un rotador de tubo. Para recoger la matriz de afinidad, coloque el tubo en el soporte magnético durante más de un minuto y retire el sobrenadante.
Saque el tubo del soporte magnético y agregue un mililitro de tampón bajo en sal. Encote suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar la matriz de afinidad y repita el lavado con tampón bajo en sal otras dos veces. Resuspender las perlas en 200 microlitros de tampón bajo en sal, para hacer 200 microlitros de matriz de afinidad.
En primer lugar, configure la amoladora de tejido para que los tubos de vidrio de PTFE se puedan colocar sobre hielo durante la homogeneización. Llene cuatro mililitros de tampón de lelisis fría en los tubos de vidrio PTFE. Poner el hígado sobre un plato de Petri.
Utilice un cuchillo para aislar de 200 a 500 miligramos de trozos de hígado y pasar a los tubos de vidrio de PTFE. Coloque el tejido hepático restante en un tubo de microcentrífuga preenfriado y congele el flash en nitrógeno líquido. Homogeneizar las muestras en un homogeneizador motor, comenzando a 300 rpm durante al menos cinco accidentes cerebrovasculares para disociar hepatocitos de la estructura hepática.
Baje el tubo de vidrio cada vez. Evitar la aireación, que podría causar desnaturalización de proteínas, manteniendo el pestle por debajo de la solución. A continuación, aumentar la velocidad a 900 rpm para homogeneizar completamente los tejidos hepáticos durante al menos 12 golpes completos.
Transfiera el izado a tubos etiquetados y pre-refrigerados con no más de un mililitro de litote cada uno. Para iniciar la lelisis nuclear, centrifugar el sete del hígado a 2.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos, luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga pre-refrigerado sobre hielo. Agregue 1/9 del volumen de sobrenadante de 10%NP-40 en el tubo de microcentrífuga sobre hielo y mezcle la solución invirtiendo suavemente el tubo.
Deslice rápidamente los tubos de microcentrífuga con una mini centrífuga y añada 1/9o del volumen de la muestra del 10%DOC. Mezcle invirtiendo suavemente los tubos de microcentrífuga y gire rápidamente por los tubos de microcentrífuga e incubar en hielo durante cinco minutos. Centrifugar el izado nuclear a 20.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga pre-enfriados sobre hielo.
Para cada tubo, saque el 1% del volumen total del sobrenadante como control de pre-inmunoprecipitación. Coloque los controles de pre-inmunoprecipitación en un rotador de tubo a cuatro grados centígrados durante la noche. Tenga especial cuidado de resuspender suavemente la matriz de afinidad pipeteando, luego agregue 200 microlitros a cada muestra.
Incubar los lysates a cuatro grados Centígrados durante la noche con una mezcla suave en un rotador de tubo. Para aislar el ARN, gire rápidamente hacia abajo los tubos que contienen los lysates en la mini centrífuga y recoja las perlas colocándolas en el bastidor magnético durante al menos un minuto. Recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga adicionales.
Agregue un mililitro de tampón fresco de sal alta a cada tubo, seguido de pipeteo suave al menos cinco veces sin introducir burbujas. Recoger las cuentas en el soporte magnético en el hielo durante más de un minuto y quitar el sobrenadante. Repita los pasos de lavado otras cuatro veces.
A continuación, retire los tubos de microcentrífuga del soporte magnético y colóquelos a temperatura ambiente durante cinco minutos para calentarlos. Resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lelisis con 0,7 microlitros de beta-mercaptoetanol para liberar ARN unido de la matriz de afinidad. Vórtice los tubos durante al menos cinco segundos a la velocidad más alta y girar rápidamente hacia abajo.
Luego, incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Coloque los tubos en el soporte magnético durante al menos un minuto, luego recoja el sobrenadante y proceda inmediatamente a la limpieza del ARN de acuerdo con el protocolo de purificación de ARN en el kit. Para lograr la máxima calidad del ARN aislado, realice todos los pasos opcionales, incluida la digestión DNase y todos los pasos de elución de ARN, incluido el precalentamiento recomendado del búfer de elución a 60 grados centígrados.
En este estudio, la fusión GFP-L10A y Fah transgenes se entregaron conjuntamente dentro de un vector de trampa de plásmido que contiene transposones a los hígados mediante inyección hidrodinámica. La eliminación de nitisinona indujo una lesión hepática tóxica. La tinción de inmunofluorescencia confirmó la coexpresión de la proteína de fusión FAH y GFP-L10A y los hepatocitos repobladores después de dos semanas de repoblación hepática.
La muestra de reposo produjo el mayor rendimiento de proteína de fusión, ya que todos los hepatocitos expresan GFP-L10A después de la inyección de AAV8-TBG-Cre. Por el contrario, apenas se detectó ARN en controles de tipo salvaje que no tenían el transgén GFP-L10A, lo que indica que el procedimiento TRAP es muy específico y tiene un fondo bajo. Cuando trap se utilizó en tejido hepático sometido a repoblación con hepatocitos transducidos por GFP-L10A, se obtuvo abundante ARN de alta calidad.
Por el contrario, no se detectó rastro de ARN a través de Bioanalyzer para la muestra de control negativo. La expresión de Gsta1 fue inducida por más de diez veces en la repoblación de hepatocitos en comparación con los hepatocitos en reposo, mientras que no se detectaron valores de ciclo de umbral con ARN aislado TRAP del ratón de tipo salvaje debido a la falta de ARN de entrada. Cuando homogeneice el tejido, asegúrese de mover el pestle lentamente para evitar la aireación.
Después de aislar el ARN, se puede realizar una secuenciación de alto rendimiento o qPCR para analizar la expresión génica. Con TRAP-seq, ahora tenemos un método para aislar específicamente el ARN de los hepatocitos repobladores y analizar el cambio en la expresión génica durante la repoblación hepática. Esto nos permite identificar genes que se alteran durante este proceso y posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de lesiones hepáticas.
La cicloheximida y la TDT, que están presentes en varios amortiguadores, son tóxicas. Los residuos deben recogerse y desecharse de acuerdo con las directrices institucionales.
