La sobreexpresación de genes en las células es una forma importante de estudiar la función génica. La transfección estable con el retrovirus permite que los genes endógenos se integren en el genoma del huésped y se expresen continuamente. Recogimos colonias individuales de la infección retroviral y generamos líneas celulares estables sobreexpresando LA DR3 con flagrante.
Las líneas celulares compensaron la indisponibilidad de un buen anticuerpo DR3 y proporcionaron excelentes herramientas para el estudio de la función DR3 post in vitro e in vivo. Generamos las líneas celulares de sobreexpresión de DR3 recogiendo una sola colonia de la infección retroviral. Las líneas celulares de una sola colonia podrían mantener la homogeneidad y pureza.
Además, el protocolo es fácil y fácil de manejar. Para comenzar este procedimiento, haga crecer las células plat-A durante la noche en platos de 60 milímetros con cuatro mililitros de DMEM. Cuando las células alcanzan el 80 al 90%confluencia, utilice el reactivo de transfección para transfeczarlas con dos microgramos del plásmido construido como se describe en el manual del fabricante.
Después de 72 horas, recoge el sobrenadante. Usando un filtro estéril de 0,45 micrómetros, filtre el medio y mantenga la suspensión viral en la oscuridad a cuatro grados centígrados. A continuación, cultivar células HT29 durante la noche en un plato de 60 milímetros con DMEM, incubando las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Cuando las células alcanzan entre el 30 y el 50% de confluencia, infectarlas con dos mililitros de suspensión viral en presencia de ocho microgramos de polibreno por mililitro de suspensión viral. Incubar las células infectadas a 37 grados centígrados durante cuatro a seis horas. Luego, aspira la suspensión viral.
Agregue cuatro mililitros de DMEM fresco y devuelva el plato a la incubadora. A las 24 horas después de la infección, retire los medios de comunicación de los platos y lave cuidadosamente las células con dos mililitros de PBS precalentó. Añadir un mililitro de trippsina EDTA, e incubar las células a 37 grados Celsius durante tres minutos.
Usando un microscopio a 10 veces el aumento, observe las células para asegurarse de que la mayoría de ellas se han desprendido. Después de esto, agregue dos mililitros de DMEM que contengan 10%FBS para detener la tripsinanización, y recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente, y retire el sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de DMEM y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, diluya las células por factores de 30, 100 y 300. Las semillas son platos de 150 milímetros que contienen cada uno de 20 mililitros de DMEM que contiene blasticidina a una concentración de un microgramo por mililitro.
Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente una o dos semanas. Durante este período, utilice un microscopio invertido a 10 veces el aumento para observar las colonias cada día. Marque las colonias bien aisladas en la parte inferior del plato cuando el diámetro de las colonias sea de aproximadamente uno a dos milímetros.
Una vez finalizado el período de incubación, aspirar el medio y lavar las células con tres mililitros de PBS precalentó. Agregue dos mililitros de tripps EDTA en un plato de 60 milímetros. Utilice fórceps estériles para recoger cilindros de clonación estériles autoclavados y colóquelos en el plato.
A continuación, recoger los cilindros que ahora contendrán aproximadamente 30 microlitros de trippsina EDTA, y colocarlos suavemente sobre las colonias marcadas. Devuelva el plato a la incubadora durante tres minutos. Después de esto, revise las células bajo un microscopio para asegurarse de que se han desprendido.
Cuando las células se han levantado, a 70 microlitros de cultivo medio a cada cilindro para inactivar la tripina. Utilice una pipeta de 200 microlitrotro para mezclar suavemente la suspensión celular, asegurándose de no mover el cilindro mientras se mezcla. Colocar dos placas de 24 pozos, y etiquetarlas la placa A y la placa B.Añadir un mililitro de DMEM a cada pozo.
Añadir 30 microlitros de suspensión celular a cada pozo de la placa A, y añadir 70 microlitros a los pozos correspondientes de la placa B.Coloque las placas de nuevo en la incubadora. Cuando las células de la placa B estén al 90% de confluencia, retire los medios y lave cuidadosamente las células con un mililitro de PBS. Se eliminó el PBS completamente, y agregue 50 microlitros de 1X SDS-PAGE buffer de carga paralyse las celdas.
Después de cinco minutos, transfiera el lysate de la célula de la placa de 24 pozos a tubos centrífugos de 1,5 mililitros. Hierva las muestras a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Ejecute las muestras en gel 10%SDS a una tensión constante de 80 voltios durante 15 minutos y luego a 120 voltios durante una hora.
A continuación, transfiera la proteína a una membrana de fluoruro de polivinilideno mediante transferencia húmeda a una corriente constante de 400 miliamperios durante dos horas. Diluir el anticuerpo primario por un factor de 5.000 en 5% de leche sin grasa que se disuelve en TBST. Añadir el anticuerpo FLAG a la membrana, e incubar a cuatro grados Celsius durante la noche.
Con una coctelera decolorante ajustada a 200 RPM, lave la membrana con TBST durante 15 minutos, refrescando el TBST cada cinco minutos. Luego, diluir un anticuerpo secundario antiratón por un factor de 10.000 en 5% de leche sin grasa. Incubar la membrana con anticuerpo secundario diluido a cuatro grados centígrados durante cinco a seis horas.
Lave la membrana en la coctelera decolorante de nuevo como se describió anteriormente. Después de esto, utilice la quimiuminescencia mejorada occidental y un sistema de documentación de gel para tomar imágenes de la membrana y detectar la expresión FLAG. En primer lugar, recoja las células HT29 y HT29-DR3 por la tripsinsticación y utilice un contador de celdas automático para medir la densidad de la celda.
Siembra las células en los pozos de placas de 12 pozos con DMEM a una densidad de 30.000 células por pozo, e incuba durante la noche a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, agregue 10 nanomolares de diazonamida a cada pozo que contenga células usando 1%DMSO como control negativo, y transfiera las placas a una incubadora a 37 grados Celsius con 5%dióxido de carbono. Después de 48 horas de tratamiento, imagine las células bajo un microscopio a 10 veces el aumento.
A continuación, sembrar células HT29 y HT29-DR3 en los pozos de placa de 96 pocillos con DMEM a una densidad de 3.000 células por pozo, y permitirles crecer a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue las concentraciones de diazonamida que aumentan la dosis como se describe en el protocolo de texto. Después de 48 horas de tratamiento, utilice un kit de ensayo de viabilidad celular basado en luminiscencia para medir la viabilidad celular.
Retire la placa de 96 pozos de la incubadora y déjela reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Luego, agregue 50 microlitros de reactivos de ensayo a cada pozo, y agite la placa durante dos minutos a temperatura ambiente para anlicenciar las células. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos, y luego utilizar un lector de microplacas para determinar la luminiscencia de cada pozo.
La caracterización de las células HT29 que expresan de forma estable la DR3 revela que los clones expresan diferentes niveles de DR3, mientras que las células de tipo salvaje no muestran expresión génica exógena. Los genes uno y cinco se ven para expresar los niveles más altos de DR3, por lo que se eligen para otros experimentos. La morfología de las células HT29 y HT29-DR3 se observa después de ser tratada durante 48 horas con diazonamida.
Las células HT29-DR3 muestran apoptosis obvia con una membrana celular rota y desechos celulares. Sin embargo, las células HT29 solo muestran un arresto mitótico con células intactas que exhiben una forma de célula redondear hacia arriba. La viabilidad celular de estos tipos celulares se determina después de ser tratada durante 48 horas con tres nanomolares de diazonamida.
Se observa que las células HT29-DR3 tienen una muerte celular de más del 80%, mientras que las células HT29 parentales demuestran sólo una ligera respuesta en forma de detención mitótica. Esto indica que la sobreexpresión de DR3 reconstituyó la vía apoptótica inducida por diazonamida en estas células. Las diluciones seriales adecuadas son importantes para obtener una densidad óptima de clones individuales.
También es importante asegurarse de que cada cilindro clon solo contenga una colonia y evitar contaminar las colonias cercanas. Las líneas celulares sobreexpresantes de DR3 facilitaron el estudio bioquímico de los mecanismos moleculares in vitro. Generamos xenoinjertos HT29-DR3 a través de la inyección subcutánea de células HT29-DR3, y ayudó a elaborar los mecanismos de apoptosis in vivo inducida por agentes antimitóticos inglés.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar genes de interés en otras líneas celulares. Además, el nocaut genético es otra forma de estudio funcional, y nuestro protocolo se puede adaptar a los sistemas de derribo genético. Por lo tanto, es generalmente aplicable a las funciones genéticas de aclarado.
Recuerde dejar el relé del virus en la basura a contenedores específicos para su eliminación de seguridad.
