Hücrelerdeki genlerin aşırı ifade etmesi gen fonksiyonlarını incelemenin önemli bir yoludur. Retrovirüs ile stabil transfeksiyon endojen genlerin konak genomuna entegre olmasını ve sürekli olarak ifade edilmesine olanak sağlar. Retroviral enfeksiyonun tek kolonilerini tespit ettik ve FLAG etiketli DR3'ü aşırı ifade eden sabit hücre hatları oluşturduk.
Hücre hatları iyi DR3 antikor yetersizliği telafi ve DR3 fonksiyon çalışma sonrası in vitro ve in vivo için mükemmel araçlar sağladı. Retroviral enfeksiyonun tek bir kolonisini tespit ederek DR3 aşırı ekspresyon hücre hatlarını oluşturduk. Tek koloniden gelen hücre hatları homojenliği ve saflığı koruyabilir.
Buna ek olarak, protokol kullanımı kolay ve basittir. Bu prosedüre başlamak için, dört mililitre DMEM ile 60 milimetrelik yemeklerde plat-A hücrelerini bir gecede büyütün. Hücreler %80 ila %90 birleştiğinde, üreticinin kılavuzunda belirtildiği gibi iki mikrogram inşa plazmid ile transfeksiyon reaktifi kullanın.
72 saat sonra, supernatant toplamak. 0,45 mikrometre steril filtre kullanarak, ortamı filtreleyin ve viral süspansiyonu dört santigrat derecede karanlıkta tutun. Daha sonra, DMEM ile 60 milimetrelik bir çanak bir gecede HT29 hücreleri büyümek, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile hücreleri kuluçka.
Hücreler %30 ila %50 birleştiğinde, mililitre viral süspansiyon başına sekiz mikrogram polibren varlığında iki mililitre viral süspansiyon ile enfekte edin. Enfekte hücreleri 37 derecede 4-6 saat kuluçkaya yatırın. Sonra, viral süspansiyon aspire.
Dört mililitre taze DMEM ekleyin ve kabı kuvöze geri verin. Enfeksiyon sonrası 24 saat, bulaşıkları medya kaldırmak ve dikkatle önceden ısıtılmış PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın. Bir mililitre tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın.
10 kat büyütme bir mikroskop kullanarak, çoğu müstakil olduğundan emin olmak için hücreleri gözlemleyin. Bundan sonra, tripsinizasyonu durdurmak için %10 FBS içeren iki mililitre DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez g santrifüj ve supernatant çıkarın.
Hücre peletini 10 mililitre DMEM'de yeniden askıya alın ve karıştırmak için hafifçe pipet yukarı ve aşağı. Daha sonra, 30, 100 ve 300 faktörleri ile hücreleri seyreltin. Tohum hücreleri her mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonda blasticidin içeren DMEM 20 mililitre içeren 150 milimetrelik yemekler.
Yaklaşık bir ila iki hafta boyunca % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçka. Bu dönemde, kolonileri her gün gözlemlemek için 10 kat büyütme de ters bir mikroskop kullanın. Kolonilerin çapı yaklaşık 1-2 milimetre olduğunda çanak altındaki iyi izole edilmiş kolonileri işaretleyin.
Kuluçka süresi tamamlandığında, orta aspire ve önceden ısıtılmış PBS üç mililitre ile hücreleri yıkayın. 60 milimetrelik bir tabağa iki mililitre tripsin EDTA ekleyin. Otoklavlı steril klonlama silindirlerini almak ve bunları tabağa yerleştirmek için steril çifenler kullanın.
Sonra, şimdi her tripsin EDTA yaklaşık 30 mikrolitre içerecek silindiralmak ve yavaşça işaretli koloniler üzerinde yerleştirin. Yemeği üç dakika boyunca kuvöze geri verin. Bundan sonra, bir mikroskop altında hücreleri kontrol edin onlar müstakil olduğundan emin olmak için.
Hücreler kalktığında, 70 mikrolitre kültür de tripsin inaktive etmek için her silindire orta. Hücre süspansiyonuna hafifçe karıştırmak için 200 mikrolitrelik pipet kullanın ve karıştırma sırasında silindiri hareket ettirmemeye özenin. İki adet 24 kuyuluk plaka yışın ve her kuyuya A ve plaka B.Add bir mililitre DMEM ekleyin.
A plakasının her kuyuya 30 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve B plakasının ilgili kuyularına 70 mikrolitre ekleyin. B plakasındaki hücreler %90 birleştiğinde, ortamı çıkarın ve hücreleri bir mililitre PBS ile dikkatlice yıkayın. PBS tamamen kaldırıldı ve hücreleri lyse için 1X SDS-PAGE yükleme tampon 50 mikrolitre ekleyin.
Beş dakika sonra hücre lisatını 24 kuyulu plakadan 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Örnekleri 100 derecede 10 dakika kaynatın. Örnekleri 15 dakika boyunca 80 volt sabit voltajda %10 SDS jel üzerinde ve ardından 120 voltta bir saat çalıştırın.
Daha sonra proteini iki saat boyunca 400 miliamperlik sabit bir akımla ıslak aktarım la poliviniliden florür membranına aktarın. TBST'de çözünmüş olan yağsız sütte primer antikor5,000 faktörle seyreltin. Flag antikorını membrana ekleyin ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
200 RPM'ye ayarlanmış renklendirici bir çalkalayıcı kullanarak membranı TBST ile 15 dakika yıkayın ve Her beş dakikada bir TBST'yi yenileyin. Daha sonra, %5 yağsız sütte 10,000 faktörile fare karşıtı ikincil antikor seyreltin. Membranı seyreltilmiş sekonder antikorla beş ila altı saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Daha önce açıklandığı gibi tekrar renklendirme shaker üzerinde membran yıkayın. Bundan sonra, membran görüntü ve FLAG ifade algılamak için Batı gelişmiş kemilüminesans ve jel dokümantasyon sistemi kullanın. İlk olarak, hem HT29 hem de HT29-DR3 hücrelerini trypsinization ile toplayın ve hücre yoğunluğunu ölçmek için otomatik hücre sayacı kullanın.
Hücreleri, kuyu başına 30,000 hücre yoğunluğunda DMEM ile 12 kuyulu plakaların kuyularına tohumlar ve %5 karbondioksitle bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, negatif kontrol olarak% 1 DMSO kullanarak hücreleri içeren her kuyuya diazonamide 10 nanomolar ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 derece santigrat bir kuvöz plakaları aktarın. 48 saatlik tedaviden sonra, hücreleri mikroskop altında 10 kat büyütülebilir şekilde görüntüleyin.
Daha sonra, hem HT29 hem de HT29-DR3 hücrelerini dmem ile 96 kuyulu plaka kuyularına, her kuyuda 3.000 hücrenin yoğunluğuna yerleştirin ve bir gecede 37 derecede büyümelerini bekleyin. Ertesi gün, metin protokolünde belirtildiği gibi doz arttıran diazonamide konsantrasyonları ekleyin. 48 saatlik tedaviden sonra, hücrenin canlılığını ölçmek için parlaklık bazlı hücre canlılığı test kiti kullanın.
96 kuyulu plakayı kuvözden çıkarın ve yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra her kuyuya 50 mikrolitre ar-geri satım ekleyin ve hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında iki dakika boyunca tabağı sallayın. 10 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka ve sonra her kuyunun parlaklık belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.
DR3'ü ifade eden HT29 hücrelerinin karakterizasyonu, klonların farklı DR3 düzeylerini ifade ederken, yabani tip hücrelerin eksojen gen ekspresyonu göstermediğini ortaya koymaktadır. Genler bir ve beş DR3 en yüksek düzeyde ifade etmek için görülür, ve böylece daha fazla deney için seçilir. HT29 ve HT29-DR3 hücrelerinin morfolojisi diazonamid ile 48 saat tedavi edildikten sonra gözlenir.
HT29-DR3 hücreleri kırık bir hücre zarı ve hücre enkazı ile bariz apoptoz görüntüler. Ancak, HT29 hücreleri bir yuvarlak hücre şekli sergileyen bozulmamış hücreleri ile sadece mitotik arrest göstermektedir. Bu hücre tiplerinin hücre canlılığı daha sonra diazonamide üç nanomolar ile 48 saat tedavi edildikten sonra belirlenir.
HT29-DR3 hücrelerinde hücre ölümü %80'in üzerinde görülürken, ebeveyn HT29 hücreleri mitotik arrest şeklinde sadece hafif bir yanıt gösterir. Bu, DR3'ün aşırı ekspresyonunun bu hücrelerdeki diazonamide bağlı apoptotik yolu yeniden oluşturduğunu gösterir. Uygun seri seyreltmeler tek klonların optimum yoğunluk elde etmek için önemlidir.
Ayrıca her klon silindirsadece bir koloni içerdiğinden emin olmak ve yakındaki koloniler kirletici önlemek için önemlidir. DR3 aşırı ekspres hücre hatları in vitro moleküler mekanizmaların biyokimyasal çalışma kolaylaştırdı. HT29-DR3 hücrelerinin deri altı enjeksiyonu ile HT29-DR3 ksenogreftleri ürettik ve in vivo'da antimitotik ajanlara bağlı apoptoz mekanizmalarının ayrıntılı olarak geliştirilmesine yardımcı oldu.
Bu protokol diğer hücre hatlarında ilgi genleri incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, gen nakavt fonksiyonel çalışma için başka bir yoldur, ve protokolümüz gen nakavt sistemlerine adapte edilebilir. Bu nedenle, genellikle gen fonksiyonlarını açıklamak için geçerlidir.
Virüs rölesini güvenlik bertarafı için belirli konteynerlere çöplere bırakmayı unutmayın.
