세포에 있는 과발현 유전자는 유전자 기능을 공부하는 중요한 쪽입니다. 레트로바이러스를 가진 안정적인 트랜스페션은 내인성 유전자가 숙주 게놈에 통합되고 지속적으로 발현될 수 있게 한다. 우리는 레트로 바이러스 감염의 단일 식민지를 집어 들고 플래그 태그 DR3를 과발현 안정적인 세포주를 생성했다.
세포주 좋은 DR3 항체의 가용성을 보상 하 고 시험관 내 및 생체 내 DR3 기능 연구 게시물에 대 한 우수한 도구를 제공. 우리는 레트로 바이러스 감염의 단일 식민지를 집어 들어 DR3 과발현 세포주를 생성했습니다. 단일 식민지에서 세포선은 균일성과 순도를 유지할 수 있었다.
또한 프로토콜은 취급이 쉽고 간단합니다. 이 절차를 시작하려면 DMEM의 4 밀리리터와 함께 60밀리미터 요리에서 하룻밤 동안 plat-A 세포를 성장시다. 세포가 80~90%에 도달하면 트랜스페트 시약을 사용하여 제조업체 매뉴얼에 설명된 대로 생성된 플라스미드의 2마이크로그램으로 트랜스펙트합니다.
72 시간 후, 상체를 수집합니다. 0.45 마이크로미터 멸균 필터를 사용하여 미디어를 필터링하고 바이러스 현탁액을 섭씨 4도에서 어둠 속에서 유지합니다. 다음으로, DMEM을 가진 60 밀리미터 접시에 있는 HT29 세포를 밤새 성장시키고, 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
세포가 30~50%의 합류에 도달하면 바이러스 현탁액의 밀리리터 당 8 마이크로그램의 폴리브레인이 있는 경우 바이러스 현탁액의 2밀리리터로 감염시킵니다. 감염된 세포를 섭씨 37도에서 4~6시간 동안 배양합니다. 그런 다음 바이러스 성 서스펜션을 흡인합니다.
신선한 DMEM 의 4 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에 요리를 반환합니다. 감염 후 24시간 동안, 접시에서 미디어를 제거하고 미리 따뜻하게 된 PBS의 2 밀리리터로 세포를 조심스럽게 씻으시다. 트립신 EDTA의 1 밀리리터를 추가하고 3 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
10 배율의 현미경을 사용하여 세포를 관찰하여 대부분의 세포가 분리되었는지 확인하십시오. 그 후, 트립시니화를 중지하기 위해 10%FBS를 포함하는 DMEM의 2밀리리터를 추가하고, 15 밀리리터 튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 200배 g의 원심분리기를 제거하고 상체를 제거합니다.
DMEM의 10 밀리리터에서 셀 펠릿을 다시 중단하고 부드럽게 위아래로 파이펫을 섞습니다. 다음으로, 세포를 30, 100 및 300의 요인에 의해 희석시 희석시. 종자 세포는 각각 밀리리터 당 하나의 마이크로 그램의 농도에 블라스티딘을 포함하는 DMEM의 20 밀리리터를 포함하는 150 밀리미터 요리입니다.
섭씨 37도에서 약 1~2주 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다. 이 기간 동안, 매일 식민지를 관찰하기 위해 10 배율에서 반전 된 현미경을 사용합니다. 식민지의 직경이 약 1 ~ 2 밀리미터 일 때 접시의 바닥에 잘 고립 된 식민지를 표시하십시오.
잠복기가 완료되면 배지를 흡인하고 미리 따뜻해진 PBS의 3밀리리터로 세포를 씻으세요. 60mm 접시에 트립신 EDTA 2밀리리터를 넣습니다. 멸균 집게를 사용하여 자동 멸균 복제 실린더를 집어 요리에 넣습니다.
그런 다음, 이제 각각 트립신 EDTA의 약 30 마이크로 리터를 포함하는 실린더를 선택하고, 부드럽게 표시된 식민지 위에 배치합니다. 접시를 인큐베이터에 3분간 반품합니다. 이 후, 현미경의 밑에 세포를 확인해서 그(것)들이 분리되었는지 확인하십시오.
세포가 들어 올릴 때, 트립신을 비활성화하기 위해 각 실린더에 배양 배지의 70 마이크로 리터에서. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하여 믹싱 하는 동안 실린더를 움직이지 않도록 하십시오. 24웰 플레이트 2개를 설정하고 접시 A와 플레이트 B.각 웰에 DMEM 1밀리리터를 추가합니다.
플레이트 A의 각 웰에 30 마이크로리터의 셀 서스펜션을 추가하고, 플레이트 B.의 해당 우물에 70 마이크로리터를 추가하여 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 플레이트 B의 세포가 90%의 합류에 있을 때, 미디어를 제거하고 PBS의 1밀리리터로 세포를 조심스럽게 씻으시다. PBS를 완전히 제거하고 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼50마이크로리터를 추가하여 셀을 lyse합니다.
5분 후, 24웰 플레이트에서 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 셀 리세이트를 전달합니다. 샘플을 섭씨 100도에서 10분간 끓입니다. 10% SDS 젤에서 15분 동안 80볼트의 일정한 전압으로 샘플을 실행한 다음 1시간 동안 120볼트로 샘플을 실행합니다.
그런 다음 2시간 동안 400밀리암페어의 일정한 전류로 젖은 이송에 의해 폴리 비닐리덴 불소 막으로 단백질을 전달한다. TBST에 용해되는 5% 무지방 우유에서 1차 항체를 5, 000의 인요인으로 희석한다. 막에 플래그 항체를 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양합니다.
200 RPM으로 설정된 탈색 셰이커를 사용하여 TBST로 멤브레인을 15분 간 세척하여 5분마다 TBST를 새로 고침합니다. 이어서, 5%의 무지방 우유에 10, 000의 계수에 의해 항마우스 이차 항체를 희석한다. 5 ~6 시간 동안 4 섭씨에서 희석 된 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오.
앞서 설명한 대로 탈색 셰이커의 멤브레인을 다시 씻으십시오. 그 후, 서양 강화 된 화학 발광 및 젤 문서 시스템을 사용하여 멤브레인을 이미지화하고 FLAG 표현을 감지하십시오. 먼저, 트립시화에 의한 HT29 및 HT29-DR3 세포를 모두 수집하고, 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 밀도를 측정한다.
세포를 30, 000 세포의 밀도로 DMEM으로 12웰 플레이트의 우물로 시드하고, 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 10 나노 몰러를 음의 대조군으로 1%DMSO를 사용하는 세포를 포함하는 각 우물에 추가하고, 5 %의 이산화탄소와 37 섭씨에서 인큐베이터로 플레이트를 전송합니다. 48 시간의 치료 후, 현미경으로 세포를 10 배율로 이미지화합니다.
다음으로, HT29와 HT29-DR3 세포를 모두 DMEM을 가진 96웰 플레이트의 우물에 잘 3, 000 세포의 밀도로 종자하고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 성장할 수 있게 한다. 다음 날, 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 복용량 에스컬레이션 diazonamide 농도 추가. 48시간의 치료 후 발광 계 세포 생존가능성 분석 키트를 사용하여 세포 생존가능성을 측정합니다.
인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 실온에서 약 30분 동안 방치하십시오. 그런 다음 각 우물에 50 마이크로리터의 분석 시약을 추가하고 실온에서 2 분 동안 접시를 흔들어 세포를 lyse합니다. 10 분 동안 실온에서 플레이트를 배양 한 다음 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 각 우물의 발광을 결정합니다.
DR3를 안정적으로 발현하는 HT29 세포의 특성화는 클론이 다양한 수준의 DR3를 표현하는 반면 야생형 세포는 외인성 유전자 발현을 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 유전자 1과 5는 DR3의 최고 수준을 표현하는 것을 볼 수 있고, 그래서 추가 실험을 위해 선택됩니다. HT29 및 HT29-DR3 세포의 형태는 다이아조나미드로 48시간 동안 치료된 후 관찰된다.
HT29-DR3 세포는 깨진 세포 막 및 세포 파편을 가진 명백한 세포사멸을 표시합니다. 그러나 HT29 세포는 반올림 세포 모양을 나타내는 그대로 세포로 미토마이트 체포만 보여줍니다. 이러한 세포 유형의 세포 생존가능성은 다이아조나미드의 3나노몰로 48시간 동안 치료된 후 결정된다.
HT29-DR3 세포는 80% 이상의 세포 사멸을 보이는 반면, 부모 HT29 세포는 미토마이트 체포의 형태로 만 약간의 반응만을 입증한다. 이것은 DR3의 과발현이 이 세포에 있는 diazonamide 유도한 세포간 통로를 재구성했다는 것을 표시합니다. 적절한 직렬 희석은 단일 클론의 최적 밀도를 얻는 데 중요합니다.
모든 클론 실린더에 하나의 식민지만 포함되어 있는지 확인하고 인근 식민지를 오염하지 않는 것이 중요합니다. DR3 과발현 세포주 체외분자 메커니즘의 생화학 연구를 촉진. HT29-DR3 세포의 피하 주입을 통해 HT29-DR3 이노이식을 생성하고 생체 내에서 항미토미티제 유도 세포사멸의 메커니즘을 정교하게 하는 데 도움이 되었습니다.
이 프로토콜은 다른 세포주에서 관심있는 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 유전자 녹아웃은 기능 적 연구를위한 또 다른 방법이며, 우리의 프로토콜은 유전자 녹다운 시스템에 적응 할 수 있습니다. 따라서, 일반적으로 유전자 기능을 해명할 수 있다.
안전 처리를 위해 바이러스 릴레이를 쓰레기에 떨어뜨리는 것을 특정 용기에 놓는 것을 기억하십시오.
