Este protocolo genera datos de transcripción de alto rendimiento de células de islotes humanos individuales, que se pueden utilizar para estudiar la heterogeneidad de células anocromo, identificar el tipo de células raras y la regulación genética en la enfermedad. Esta técnica genera datos de celda única a mayor escala, es fácil de usar y tiene un tiempo de procesamiento bastante corto. Este método se puede aplicar a islotes de otras especies y para perfilar otros tejidos recién aislados.
Sin embargo, el protocolo debe optimizarse para adaptarse a los procedimientos de disociación específicos de los tejidos. Es fundamental preparar células disociadas de alta calidad. QC de la suspensión celular antes de la partición de una sola célula es clave, al igual que el manejo de la emulsión con cuidado y rapidez.
Algunos puntos de control de calidad como saber si un chip se ha obstruido son mejor vistos que leídos. Después de obtener islotes humanos e incubar durante la noche, cuente y seleccione a mano de 200 a 300 islotes utilizando una pipeta P200. Transfiera los islotes a un tubo cónico de 15 milímetros que contenga cinco milímetros de medio de islote completo, precalegado a 37 grados centígrados.
Coloque el tubo en una centrífuga a 200 veces G durante dos minutos. Aspirar suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet en la parte inferior. Agregue un milímetro de solución de disociación celular precalentada e interrumpa el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
Incubar los islotes a 37 grados centígrados durante nueve a 11 minutos. Cada tres minutos, pipetea hacia arriba y hacia abajo lentamente durante 10 segundos para disociar las células en células individuales. Una vez que las células del islote estén bien disociadas y la solución se nubla, agregue nueve mililitros de medios de islote completo y filtre a través de un colador celular de 30 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
Recoger las células por centrifugación a 400 veces G durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 200 a 300 microlitros de solución 1X PBS 04%BSA. Ahora, mezcle 10 microlitros del cultivo celular con 0,5 microlitros de AO/DAPI.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Cargue 10,5 microlitros en una diapositiva y ejecute el ensayo de recuento de células en un contador de células automatizado basado en fluorescencia para determinar el recuento y la viabilidad. Coloque un chip microfluídico en una caja de virutas.
Oriente la caja de la viruta, asegurando que los pozos de petróleo estén más cerca de la persona que realiza el experimento. Utilice una pipeta para añadir el volumen calculado de células en las tiras de tubo preparadas. Pipeta para mezclar cinco veces.
Sin descartar las puntas de la pipeta, transfiera 90 microlitros de la mezcla celular a la fila de uno de los chips. Espere 30 segundos, luego pipetear muy lentamente para cargar 40 microlitros de cuentas de gel a la fila dos. Dispensar 270 microlitros de aceite de partición a los pozos de la fila tres.
Enganche la junta de viruta a las pestañas del soporte de la viruta. Coloque el soporte de chip montado en el dispositivo de partición de una sola celda y pulse el botón de ejecución. Al finalizar la ejecución, retire la junta de viruta del soporte, abra la caja de la viruta en un ángulo de 45 grados y transfiera 100 microlitros de la emulsión de la viruta a un pozo en una placa de plástico azul de 65 pozos.
Dispensar 125 microlitros de reactivo de rotura de emulsión rosa en cada emulsión. Espere un minuto y transfiera todo el volumen de cada pozo a cada tubo de 0,2 mililitros. Asegúrese de que haya una capa de claro y una capa de rosa en la tira del tubo.
Con una pipeta, retire 125 microlitros de la capa rosa de la parte inferior de la tira de tubo sin alterar la capa transparente. Es normal que un pequeño volumen de aproximadamente 15 microlitros de la capa rosa permanezca en el tubo. A continuación, agregue 200 microlitros de mezcla de limpieza a cada una de las tiras de tubo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Transfiera las tiras de tubo a un soporte magnético y espere dos minutos para permitir que la solución se despeje. Retire el sobrenadante y deseche. A continuación, lave las cuentas con 80% de etanol dos veces.
Deje que las cuentas se sequen durante un minuto. Retire las tiras de tubo del imán y agregue 35,5 microlitros de solución de elución a las perlas. Pipetear para volver a suspender las perlas de la solución e incubar durante dos minutos a temperatura ambiente.
Transfiera las tiras de tubo a un soporte magnético y permita que la solución se despeje. Transfiera el ADN complementario purificado de las tiras de tubo para limpiar las tiras de tubo de 0,2 mililitros. Para amplificar el ADN complementario, primero agregue 65 microlitros de mezcla maestra de amplificación de ADN complementaria a cada muestra.
Coloque las tiras de tubo en un termociclador y ejecute el programa de acuerdo con el manuscrito. Las muestras se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de 72 horas. Después de normalizar el ADN complementario a 15 anagramas y 20 microlitros, aliquot 30 microlitros de la mezcla de etiquetado a cada muestra de ADN complementaria sobre hielo.
Ponga las muestras en el termociclador y ejecute el protocolo de etiquetado a 55 grados centígrados durante cinco minutos, disminuyendo a 10 grados centígrados y sosténjes. A continuación, añada 60 microlitros del índice de muestra PCR Master Mix y 10 microlitros del índice de muestra de forolegol de 20 micromolares a la muestra de ADN complementario purificado de 30 microlitros. Devuelva los tubos al termociclador para amplificar el producto de la biblioteca final.
Normalice cada muestra con agua a dos nanogramos por microlitro y tire de tres microlitros de cada muestra normalizada juntos en un tubo de 1,5 mililitros. Agrupación diluida con tampón de elución a 0,25 nanogramos por microlitro. Desnaturalizar la piscina mediante la combinación de 12 microlitros de la muestra de piscina diluida, un microlitro de un animal o control de ADN, dos microlitros de tampón de elución y cinco microlitros de 0,4 hidróxido de sodio normal.
Incubar la mezcla durante cinco minutos, luego añadir 10 microlitros de 200 tris mililolares a pH8, y cargar 4,05 microlitros de la mezcla en 1345,95 microlitros de HTA-1. A continuación, cargue 1,3 mililitros en el cartucho del secuenciador y funcione de acuerdo con las directrices del fabricante utilizando una receta de secuenciación. En el equipo, ejecute Cell Ranger para desmo multiplexar archivos de llamada base sin procesar generados por la secuenciación en archivos FASTQ.
Alinee los archivos FASTQ con el conjunto del genoma humano b37.3 y utilice el modelo de gen CSC para obtener la cuantificación de expresiones. Examine la gráfica de clasificación del código de barras para asegurarse de la separación de los códigos de barras asociados a la celda y el fondo. Para controlar la calidad celular, excluya las células con menos de 500 genes detectados, menos de 3.000 de número total de identificadores moleculares únicos y una puntuación de viabilidad superior a 0,2.
Ajuste los cortes según los tipos de tejido y células. A continuación, usa R package mclust para eliminar las células que expresan más de un gen hormonal. Utilice seurat de paquete R para normalizar la expresión génica por los identificadores moleculares únicos totales y multiplicar por un factor de escala de 10.000 a nivel de célula.
Luego detecte genes variables usando la expresión media y la dispersión de todas las células. Ajuste los cortes de acuerdo con el tejido y los tipos de células. Realice el análisis del componente principal con los genes variables.
Agrupar celdas con un número seleccionado de componentes principales. Derive genes enriquecidos por racimos de células comparando un grupo celular con el resto de las células. En este protocolo de secuenciación de ARN de célula única, los islotes humanos adquiridos fueron disociados por primera vez según lo validado por las células alfa y beta en fluorescencia de ARN e hibridación C2.
Un ejemplo exitoso de emulsión después del paso de partición muestra una solución uniforme pálida y turbia con aceite de partición mínima separado de las perlas de gel. Por el contrario, una emulsión de mala calidad con separación de fase clara entre las perlas de gel y el aceite podría deberse a un obstrucción durante la ejecución de la viruta. Después de la amplificación complementaria del ADN, una distribución representativa del tamaño de un fragmento muestra el pico típico para una muestra de ADN complementaria de buena calidad que residió cerca de 1.000 a 2.000 pares de bases.
El pico cerca de 600 pares de bases era específico para el ADN complementario de los islotes. La distribución del tamaño de fragmento para las bibliotecas de secuenciación de ARN estaba entre 300 y 500 pares base. El análisis de agrupación en clústeres reveló 12 tipos de celdas en el espacio de dimensiones de incrustación de vecino estocástico distribuido en T.
Se revelaron tres submodas en células alfa y cuatro en células beta. Esta técnica permite a los investigadores construir un islote celular completo para los islotes humanos. Con más datos de donantes no diabéticos y diabéticos, se utiliza como recurso para el descubrimiento terapéutico de objetivos.
