Se han observado comunidades bacterianas intracelulares, o IBC, en ratones a los que se les han administrado infecciones experimentales del tracto urinario, o infecciones urinarias. También se han visto en los sedimentos de orina de pacientes con infección urinaria humana. La técnica que estamos describiendo hoy en día es una manera de aislar iPC individuales de ratones infectados experimentalmente.
La técnica de micropipetting bucal es la única técnica actualmente disponible para aislar bacterias intracelulares de vejigas de ratón infectadas. Para preparar pipetas de boca de vidrio, pellizca firmemente ambos extremos de un tubo capilar de vidrio y gire uniformemente el centro del tubo hacia adelante y hacia atrás a lo largo de su eje sobre una fuente de llama abierta. Cuando el vidrio se ablande, retire el capilar de la fuente de calor y tire inmediatamente del vidrio.
La longitud final ideal del capilar tirado es de tres a cinco centímetros más largo que un capilar sinpulsar para asegurar un diámetro interno adecuado para aislar las células epiteliales de una sola vejiga. Cuando el vidrio se haya enfriado, compruebe si el centro del capilar de vidrio es más estrecho y que el interior del tubo sigue siendo hueco. Recogiendo el extremo grande del capilar tirado con una mano, utilice fórceps para agarrar el capilar en su punto más estrecho, asegurándose de que los fórceps se empuñan con suficiente fuerza para agarrar el capilar firmemente sin aplastarlo.
Gire rápidamente los fórceps para romper el capilar tirado en el punto más estrecho. A continuación, coloque el capilar del tamaño de una micropipeta en la boca en un plato de Petri de 100 milímetros y los rayos UV esterilizar el plato durante 30 minutos. Para cosechar la vejiga, coloque un ratón en la posición supina y esterilizar la zona abdominal con 70%etanol.
Usando fórceps esterilizados con etanol y tijeras quirúrgicas, haga una incisión inicial de la piel transversal de un centímetro por encima de la abertura uretral y expanda la incisión diagonalmente hacia las extremidades superiores del ratón para crear un corte en forma de V a lo largo de todo el anterior del ratón que expone el contenido del peritoneo. Usando nuevas herramientas esterilizadas, empuje suavemente hacia abajo en las almohadillas de grasa cerca de la región pélvica del ratón para hacer que la vejiga sobresalga y agarre la vejiga expuesta en el ápice. Manteniendo un agarre firme en la vejiga, cortar los uréteres y la uretra para liberar la vejiga e insertar la punta de un eje de fórceps redondeados en la abertura de la vejiga donde se acaba de incitar.
Suelte los fórceps agarrando el ápice y manteniendo los fórceps redondeados casi completamente cerrados, utilice un segundo par de fórceps para tirar suavemente del extremo exterior de la boca de la vejiga lejos de los fórceps redondeados y alrededor y sobre la otra punta de los fórceps redondeados para girar la vejiga de adentro hacia afuera. Luego, utilice el segundo par de fórceps para persuadir suavemente a la vejiga invertida de la punta de los fórceps en un mililitro de PBS frío. Y raspa suavemente la capa interna de células epiteliales en el exterior de la vejiga invertida con dos pares de fórceps limpios.
Cuando todas las células hayan sido raspadas, inserte el extremo sinpulchar de un capilar de vidrio tirado en el tapón de goma de un tubo de aspirador y ajuste firmemente el extremo estrecho de una punta de pipeta de un mililitro en el otro extremo abierto del tubo. Ajuste firmemente el extremo estrecho de una pipeta de aspiración de dos mililitros en el extremo abierto y más ancho de la punta de la pipeta de un mililitro y coloque la suspensión de celda raspada bajo un microscopio de disección. Usando un aumento de 20 a 40X, identifique los IBC como grandes agregados fluorescentes y sumerja el extremo fino del capilar de vidrio en un tubo fresco de PBS durante un segundo para reducir la absorción de volumen no deseado a través de la acción capilar.
Cuando se haya localizado un IBC de interés, lentamente lleve el extremo abierto del tubo capilar hacia el IBC y aplique una fuerza de succión muy pequeña a la pipeta de aspiración para guiar el IBC hacia el capilar de vidrio. A continuación, mueva el capilar a un tubo centrífugo vacío de 1,5 mililitros y aplique una ligera presión positiva para expulsar la gota y el IBC al tubo. Además de la confirmación de la presencia de un solo IBC aislado en el tubo de recogida a través del microscopio de disección, la pureza del IBC aislado puede ser confirmada por microscopía confocal.
Las células aisladas deben mancharse tanto para E.coli como para uroplakin y deben tener entre 50 y 120 micrómetros de tamaño. Después del aislamiento, la presencia y viabilidad de las células bacterianas en el IBC individual se puede confirmar a través de la cuantificación de la unidad formadora de colonias o la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa para equivalentes genómicos. En particular, las células epiteliales no infectadas aisladas con el mismo protocolo no demuestran cantidades cuantificables de bacterias.
Además, el análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa confirma la presencia de genes bacterianos en una gama de IBC aislados individualmente y agrupados. Asegúrese siempre de que una micropipeta de la boca pueda recoger y expulsar el líquido fácilmente. No dude en cambiar el capilar o todo el aparato si la micropipeta de la boca se siente ocluida.
Esta técnica de micropipetting bucal nos permite estudiar directa y específicamente las poblaciones intracelulares que se forman durante una infección urinaria experimental. Sin esta técnica, esas poblaciones intracelulares estarían contaminadas y superadas en número por las bacterias extracelulares. Algunos otros agentes infecciosos pueden ser más fácilmente aerosolizados o transmitidos que el E.coli que hemos utilizado en esta aplicación.
En estos casos, algunos controles adicionales pueden estar garantizados, como agregar un filtro o extender el tubo, dependiendo de la aplicación que se esté utilizando. Los IBC aislados mediante esta técnica de micropipetting de la boca pueden utilizarse en otros análisis de células individuales aguas abajo, como QRTPCR o secuenciación de ARN.
