Los autores desean agradecer a Shelly Xie y Jennifer Payne por su asistencia técnica de expertos. Este trabajo fue posible gracias a donaciones de la Sociedad de Urología Pediátrica y el Fondo de Stanford Pediatric Research.

I. Preparación de sondas uretrales <ol><li> Para cada uno de vejiga y los riñones del ratón para el muestreo, lugar 5-6 gotas de acero inoxidable (vejiga, el tamaño de 1,6 mm o de 0,9 a 2,0 mm mezcla) o granos de óxido de circonio (de los riñones, el tamaño de 0,5 mm) en un tubo de criovial, respectivamente. Autoclave de los tubos de cuentas que contienen. </li><li> Después de los tubos de enfriar a temperatura ambiente, añadir 200 microlitros de PBS estéril a cada cordón de acero inoxidable que contiene el tubo y 400 microlitros de PBS estéril a cada grano de óxido de zirconio que contiene el tubo. </li><li> Preparamos sondas uretrales según lo descrito por Hung y Hultgren 13. Autoclave un par limpio de cabeza plana de pinzas y tijeras finas (iris o similar) y permitir que los instrumentos que se enfríe a temperatura ambiente. Limpie las superficies de una campana de flujo laminar con etanol al 70%. En la capilla, un corte de 30 cm (aproximado) del segmento de tubería de polietileno. Asépticamente a cabo una aguja de calibre 30 estéril (la aguja larga 1 / 2 pulgada) en una jeringa estéril de 3. Levante un extremo de la tubería de polietileno cortada con la pinza en autoclave y deslice el tubo en la aguja hasta que se encuentra el centro. Cortar el tubo a fin de que aproximadamente 2 cm se extiende más allá de la punta de la aguja. Retirar el catéter de la jeringa y coloque en un plato de Petri estériles. </li><li> Para reducir la probabilidad de contaminación cruzada, hacemos un catéter para cada ratón. Después de todos los catéteres se hacen, esterilizarlos por la exposición en una placa de Petri descubrió que la radiación UV por lo menos durante 30 minutos. No mire directamente a las lámparas UV o exponer cualquier parte del cuerpo en la capilla mientras que las lámparas se activan. Después de la exposición UV, los catéteres se pueden almacenar a largo plazo en la placa de Petri. Se recomienda sellar el plato con Parafilm para ayudar a mantener la esterilidad. </li></ol> II. La inoculación de los animales <ol><li> Los ratones deben llegar por lo menos una semana antes de la manipulación experimental con el fin de evitar la tensión inducida por factores de confusión. Los ratones hembra que se utilizan debido a que la uretra ratón macho es extremadamente difícil para la cateterización. CBA / J es un comúnmente utilizados, UTI-susceptibles cepa de ratones endogámicos. Los ratones se debe utilizar entre 8 y 12 semanas de edad, ya que esta es la ventana de la madurez inmunológica antes de la senescencia. En el primer día del experimento, sumergir el extremo de un lazo de inoculación estéril en un vial de las acciones de bacterias congeladas. Raspar un inóculo pequeño y fuera racha en una placa de agar apropiado. En general, los uropatógenos E. coli (UPEC) y otras cepas pueden ser cultivadas durante la noche en Luria-Bertani (LB) de agar a 37 ° C en el aire ambiente. Cepas UPEC crecer como sólida, de color blanco amarillento colonias translúcidas en agar LB. De inmediato a la acción bacteriana en el congelador. Cepas de uropatógenos bacteriana puede llegar a ser menos virulento en el tiempo con cultivos repetidos en serie. Por lo tanto, se recomienda en estrías, una placa de agar fresco para cada experimento. </li><li> El día 2 del experimento, después de confirmar morfología de las colonias adecuada, elegir una sola de las colonias de las placas de agar y el lugar por lo menos en 5 cc de caldo de cultivo durante la noche. Caldo de LB se pueden utilizar para la mayoría de las cepas de uropatógenos bacteriana (37 ° C, 200 rpm en el aire ambiente). Mantenga las tapas sueltas en los tubos de caldo de cultivo para permitir la aireación. </li><li> El día 3 del experimento, tienen el 10% de caldo de cultivo primera y la cultura en el caldo de nuevo durante la noche (normalmente 37 º C y 200 rpm), para mejorar la expresión de tipo I pili. Los cultivos seriados de caldo de ayudar a optimizar uropathogenicity bacteriana, ya que el tipo I pili han demostrado ser un factor de virulencia crítica para los uropatógenos en vivo 1. Mantenga las tapas sueltas en los tubos de caldo de cultivo para permitir la aireación. </li><li> El día 4 del experimento, medir el diámetro exterior de 600 de caldo de cultivo a partir del día 3. Si no es ya conocido por la cepa bacteriana que se prueba, realizar diez veces dilución en placas en serie en al menos 7 registros (diluciones realizadas con PBS, cultivos realizados en agar LB, de 37 ° C de incubación durante la noche) para determinar la relación entre el OD y 600 ufc / ml. Como regla general, una OD 600 de 0,4-0,5 comúnmente corresponde al 1-2x10 7 ufc por 50 microlitros. Una vez que la relación entre el OD y 600 ufc / ml ha sido determinada, se puede ajustar el caldo de cultivo para el OD 600 correspondiente a la ufc deseada por ratón en 50 microlitros de PBS. Algunos trabajos han sugerido que la inoculación de 10 microlitros, en lugar de 50, lleva a un menor de reflujo en el kidneys6. Sin embargo, la mayoría de las publicaciones han reportado el uso de 50 microlitros por ratón. En general, los rangos de ufc deseado entre 10 6 y 108 ufc / ratón, pero cada combinación de la cepa bacteriana / ratón debe ser probado empíricamente en vivo. </li><li> Para ayudar a asegurar que inóculos no se anulan inmediatamente después de la instilación, los ratones deben ser privados de agua durante por lo menos 30 minutos antes de la inducción de la anestesia general. Otra maniobra clave para inducir la evacuación antes de la inducción de la anestesia por scruffing ratones y presionando suavemente el abdom menoren. Dos a un 2,5% isoflurano es una dosis de inducción segura por 8-12 semanas de edad, los ratones hembra CBA, seguido de mantenimiento de la anestesia con isoflurano 1,8-2%. </li><li> Una vez que la anestesia se logra, los ratones se colocan en posición de decúbito supino con la cabeza insertada en una ojiva conectado a isoflurano que contienen oxígeno. La parte inferior del abdomen es un masaje para evacuar la orina desde la vejiga. Si la vejiga está relativamente vacío, esta maniobra no puede producir orina. La parte inferior del abdomen y el perineo está empapado con etanol al 70%. </li><li> Un estéril jeringa de 1 cc sin aguja se utiliza para la elaboración del inóculo deseado bacteriana. A continuación, un catéter uretral estéril asépticamente colocada en la jeringa. El exceso de tubo se corta el catéter con un par de tijeras para que sólo 2.1 milímetros de tubería de permanecer distal a la punta de la aguja. Entonces, la jeringa se aprovecha y el émbolo de la depresión con la jeringa en posición vertical para eliminar todas las burbujas. Una cucharada de jalea lubricante bacteriostático se roció sobre una placa de Petri estéril o en el interior de la envoltura jeringa estéril. La punta del catéter (con jeringa adjunta) se sumerge en la jalea. Si hay varias cepas de bacterias se están probando en el mismo experimento, tenga cuidado de no utilizar la misma gota de jalea para lubricar los catéteres que contienen diferentes cepas. </li><li> El uso de un microscopio estereoscópico (0.8x de zoom 5x) para la ampliación, la capucha del clítoris con el ratón anestesiado con suavidad, tomado en la mano no dominante con un par de pinzas de dientes finos y se crió cefálica para exponer el meato uretral profundidad de color rosa ( Figura 1). La jeringa (con sonda conectada) se sujeta en la mano dominante, con un agarre lápiz y la punta del catéter está involucrado en el meato uretral en un ángulo de 45 grados. La capucha del clítoris está extendida a lo largo del eje longitudinal de la jeringa, con eficacia &quot;carga&quot; de la uretra en el catéter. Esta maniobra es esencial, ya que la uretra del ratón es redundante. El catéter debe introducirse con facilidad en la vejiga (hasta el centro, la figura 2), y se puede girar suavemente para ayudar a navegar los pliegues redundantes de la uretra. Una vez que el catéter se hubbed, la jeringa se puede reducir hasta que quede paralela al eje largo del mouse. La mano no dominante puede dejar las pinzas para ayudar a estabilizar la posición del catéter y la jeringa en la mano dominante se utiliza para inyectar lentamente el inóculo (por lo menos 5 segundos). Si el líquido se ve que fluye alrededor de la sonda durante la inyección, ya sea que la vejiga está llena o el catéter está en la vagina (justo caudal a la uretra). La inyección debe detenerse inmediatamente y la posición del catéter cuidadosamente examinada. Si el catéter se encontraba en la uretra, el ratón dado no deben ser incluidos en el experimento. Por otro lado, un catéter mal colocado en la vagina puede cambiar de posición y la reinyección intento. Después de la inyección, el catéter y la jeringa se retira lentamente desde el ratón. </li><li> Para reducir la probabilidad de los primeros después de la inoculación la micción, lo cual puede evacuar a las bacterias administrada y por lo tanto llevar a los niveles de infección variables, algunos investigadores mantienen los ratones bajo anestesia durante 30 minutos después transuretral inoculation10. Después de la cirugía, los ratones se recuperará en una manta térmica limpia con la observación continua para confirmar cambio de los patrones de respiración y la actividad normal. Una vez que los animales se han recuperado totalmente la capacidad de arrastre, que pueden ser devueltos a las camas-jaulas que contienen. </li></ol> III. UFC medir en el tejido infectado <ol><li> Diversas publicaciones del ratón IU han informado sobre los resultados del cultivo de 6 horas a una semana o más después de la inoculación. Los puntos de tiempo óptimo necesario determinar empíricamente para cada combinación de cepas bacterianas / ratón. Orina evacuada se obtiene de la cultura por scruffing ratón sobre una placa de Petri estéril. Orina recolectada debe mantenerse en hielo en todo momento. Múltiples intentos para obtener orina evacuada durante varias horas puede ser necesaria, ya que la micción frecuente del ratón es el volumen, baja (30 a 100 microlitros por vacío), y el estrés-dependiente. </li><li> Después de la obtención de muestras de orina anulado, sacrificamos los ratones por dislocación cervical y el isoflurano. El abdomen está abierto asépticamente. Si la muestra de orina evacuada, no se obtiene con éxito antes, una pequeña cantidad de orina a menudo pueden ser aspiradas a través de la pared de la vejiga usando una aguja de calibre 30 y una jeringa. </li><li> Uno o ambos riñones se eliminan, picada en al menos 4 piezas (cada pieza debe ser inferior a 50 microgramos) en una placa de Petri estéril, y se coloca en circonio de cuentas / PBS que contiene crioviales en el hielo. Se extirpa la vejiga, picada en al menos 4 piezas, y se coloca en acero inoxidable de grano / PBS que contiene crioviales en el hielo. El tejido / grano / PBS que contiene crioviales se colocan en una bala Blender homogeneizador y los tejidos se homogeneizan con el &quot;8&quot; ajuste de la velocidad durante un minuto. Es común que algunos fragmentos de tejido a permanecer después de la homogeneización. Mientras 50-100 microlitros de líquido homogeneizado puede ser una pipeta, fragmentos sólidosno son necesariamente un problema. Si el tiempo es mayor homogeneización de algunos ejemplos, es muy importante hacerlo para todos los tejidos con el fin de mantener la coherencia de la homogeneización. Utilizamos una bala Blender homogeneizador, ya que evita la posibilidad de contaminación cruzada, es más rápido que el procesamiento de muestras individuales, uno por uno usando un homogeneizador estándar, y no de manera significativa el calor de las muestras se homogeneizaron. </li><li> Por lo menos dos o tres de diez diluciones de la orina recolectada y homogeneizados de tejido debe ser hecho en una placa de microtitulación. Para los experimentos preliminares, puede ser prudente para que al menos siete de diez diluciones. La cultura hasta 100 microlitros de la orina, la vejiga y / o homogeneizados renales en agar apropiado. Dado que las muestras de orina puede ser de volumen limitado, puede ser necesario para que sus volúmenes de 100 microlitros antes de realizar diez diluciones. Si esto es necesario, la dilución inicial (antes de las diez veces dilución) tendrá que tenerse en cuenta en los cálculos finales de los rendimientos de las bacterias. Nosotros preferimos el cultivo de la UPEC en el azul de metileno o eosina-agar MacConkey (una noche de incubación a 37 ° C), ya que estos medios son selectivos para los microorganismos gramnegativos. Cepas UPEC crecen en agar MacConkey como centro umbilicadas, de color rojo-rosado colonias debido a su capacidad de fermentar la lactosa. </li><li> Después del cultivo durante la noche, contar con la UFC por cada plato. Para las muestras diluido en serie, la dilución de la placa que contiene 50 a 100 colonias se considera los resultados más exactos. &quot;Volver&quot; calcular ufc por los tejidos, por miligramo de tejido, o por ml. </li></ol> IV. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Meato uretral (tejido de color rosa oscuro) expuesta por el levantamiento de capuchón del clítoris cefálica con fórceps (más allá de la parte superior de la foto) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Sondaje uretra. El clítoris bífido se puede ver justo por encima de la sonda. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Vejiga ufc cuenta dos días después de la infección transuretral de 8 semanas de edad CBA / J ratones con uropatógenos E. coli. Vejigas se homogeneizaron y se determinó ufc / ml mediante siembra de diluciones en serie en agar MacConkey. Diamantes indican ufc / ml en los ratones individual, barra horizontal indica la mediana ufc / ml.

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. 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La inducción de la infección del tracto urinario del ratón mediante la inoculación de bacterias transuretral es un procedimiento de larga data, pero técnicamente exigente 11. Colgado y Hultgren ha publicado recientemente una excelente revisión de las técnicas transuretral de infección del tracto urinario del ratón 13. En este trabajo, se intenta ilustrar los puntos más importantes de este enfoque experimental. Los principiantes pueden practicar su técnica med...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

Cepas bacterianas uropatógena de interés se cultivan en agar. En general, los uropatógenos<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) y otras cepas pueden ser cultivadas durante la noche en Luria-Bertani (LB) de agar a 37 ° C en el aire ambiente. Cepas UPEC crecer como colonias de color blanco amarillento translúcido en LB agar. Tras la confirmación de la morfología de las colonias apropiadas, las colonias solo entonces se escogió para ser cultivadas en caldo. Caldo de LB se pueden utilizar para la mayoría de cepas bacterianas uropatógenos. Dos culturas de serie, la noche de caldo de LB se pueden emplear para aumentar la expresión de pili de tipo I, un factor de virulencia bien definidas para las bacterias uropatógenos. Caldos de cultivo se diluye a la concentración deseada en tampón fosfato salino (PBS). De ocho a 12 semanas de edad ratones hembra se colocan bajo anestesia con isoflurano y transuretral inoculadas con las bacterias mediante tubos de polietileno cubiertas de 30 jeringas de calibre. Inóculos típico, el cual debe ser determinada empíricamente para cada combinación de cepas bacterianas / ratón, son 10<sup&gt; 6</sup&gt; A 10<sup&gt; 8</sup&gt; UFC por ratón de 10 a 50 microlitros de PBS. Tras el periodo de infección deseado (un día a varias semanas), las muestras de orina y la vejiga y los riñones tanto se cosechan. Cada órgano es picado, colocado en PBS, y se homogeneizaron en un homogeneizador Bala Azul. Homogeneizados de orina y el tejido se diluyen en serie en PBS y se cultivaron en agar apropiado. Al día siguiente, las unidades formadoras de colonias se cuentan.

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Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Este video se muestran los métodos para inducir transuretral infecciones del tracto urinario ratón y cuantificar la extensión de las infecciones resultantes.

Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.5K vistas.  Stanford University. Este video se muestran los métodos para inducir transuretral infecciones del tracto urinario ratón y cuantificar la extensión de las infecciones resultantes.

Video: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Preparación de inmunógeno ratón hipófisis para la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

Procedimiento transuretral instilación en ratón macho adulto

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Modelos de ratón de la infección por Helicobacter y patologías gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Aislamiento de las comunidades bacterianas intracelulares solo generados a partir de un modelo murino de infección del tracto urinario para posteriores análisis unicelular

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Inducción de lesión pulmonar de ratón por inyección endotraqueal de bleomicina

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...