Este proyecto fue financiado por los institutos nacionales de salud en GM018568. Este protocolo fue realizado en parte en el centro de sistemas de nanoescala (CNS), un miembro de la nacional nanotecnología coordinada infraestructura red (NNCI), que es apoyado por la National Science Foundation bajo premio NSF no. 1541959. CNS es parte de la Universidad de Harvard. Muchas gracias son debido a Thomas Norman y Nathan Lord por su trabajo en la concepción y fabricación de la plantilla principal utilizada para los dispositivos que se muestra aquí y en la construcción de la versión original del aparato. También agradecemos sus valiosos consejos de colaboración de Johan Paulsson y gracias a los miembros de su laboratorio para su asesoramiento y mejoras continuas para aparatos de microfluidos bacteriana.

1. PDMS dispositivo Casting
<ol><li>En un ambiente libre de polvo, mezclar polímeros PDMS y agente endurecedor en una proporción 10:1 y desgasificación bajo vacío durante al menos 10 minutos.</li>
	<li>Coloque un maestro de silicio (o una réplica de epoxy o de poliuretano mismo) en un pedazo de papel de aluminio intacto en una placa de Petri de poliestireno. Vierta la mezcla desgasificada de PDMS sobre el amo a una profundidad de aproximadamente 5 mm. Degas la placa de Petri durante al menos 10 min uso un chorro suave de aire para romper burbujas superficiales. Nota: Las dimensiones de los dos niveles del dispositivo utilizado son proporcionadas de los CAD archivo5 (véase la archivo adicional 1). Una réplica de plástico master puede flotar parcialmente durante la desgasificación; Si esto ocurre, presione hacia abajo la réplica con un aplicador de plástico.</li>
	<li>Cura la PDMS para al menos 1 h en una estufa a 60 ° C y enfriar a temperatura ambiente. Quitar la lámina de aluminio que contiene el PDMS maestro y curado de la placa de Petri. Retire cuidadosamente el papel de aluminio de la parte posterior del maestro, luego Pelar cuidadosamente el PDMS del maestro. Nota: Como alternativa, PDMS puede curar durante la noche a temperatura ambiente. La relativa fragilidad de un maestro de la oblea de silicio se puede superar mediante el uso de adhesivo epoxi para unir permanentemente la oblea a un 1/16 de pulgada-disco de aluminio de espesor de la misma medida de la oblea.</li>
	<li>Como una oblea por lo general incluye varios dispositivos microfluídicos con dimensiones ligeramente diferentes (véase la archivo adicional 1), corte de un solo dispositivo a la medida utilizando un bisturí limpio y afilado. Nota: Para la rutina de trabajo B. subtilis , utilizar dispositivos con trincheras de 1.0 μm de toda célula, que están marcados con una C o F en el archivo de CAD.</li>
</ol>2. dispositivo de perforación y de la vinculación
<ol><li>Lugar un pedazo de oficina translúcida de la cinta (véase Tabla de materiales) sobre el lado del estampado del dispositivo para mejorar la visibilidad de las características modeladas. Los puertos de entrada y salida se identifican como áreas circulares en los extremos opuestos de los canales fluídicos visibles (figura 1). Para mejorar su visibilidad al perforar los agujeros en el dispositivo para los pines de entrada y de salida, marque las entradas y salidas con puntos con un marcador de punta fina. Nota: Para asegurarse de que los pines de entrada y salida no se llena de gente, todos los otros canales es perforado, empezando con el canal justo debajo el designador alfabético para el dispositivo.</li>
	<li>El dispositivo PDMS del tirón por lo que es la parte estampada hacia abajo y perforar a través del dispositivo a los puntos marcados con un punzón de biopsia de 0,75 mm; descartar la rotura. Nota: Los dispositivos se perforan con el estampado hacia abajo porque el agujero generado por el punzón de biopsia típicamente ligeramente acampanado en el punzón entra en el polímero. El dispositivo en una orientación invertida de perforación asegura que el agujero en el lado estampado tiene un borde afilado.</li>
	<li>Mediante un estereomicroscopio, asegúrese de que los orificios perforados se traslapan con las áreas de entrada y salida del dispositivo. Utilice unas pinzas de punta fina para quitar cualquier fragmentos extraños de PDMS de los agujeros perforados.</li>
	<li>Utilice cinta adhesiva para quitar el polvo de ambos lados del dispositivo y coloque en una placa de Petri Poliestireno limpio. Preparar un vaso de tapa 22 x 40 mm mojando con 100% de alcohol isopropílico y frotando con un trapo para salas blancas; seca con un chorro de aire libre de polvo o de nitrógeno.</li>
	<li>Colóquela perforado PDMS dispositivo característica lo para arriba junto con el cristal limpio en un plasma de oxígeno.<ol>
<li>Plasma-tratar el dispositivo con los ajustes siguientes: vacío, mTorr 70; O presión de2 , 200 mTorr; duración, 15 s; potencia 30 w. inmediatamente después de que termine el período de tratamiento de plasma, quite el dispositivo y la cubierta de vidrio del plasma limpiador.</li>
		<li>Invierta el PDMS y coloque en el centro del vidrio de cubierta de modo que el lado estampado contacto con el vidrio; Asegúrese de que los canales de alimentación (corriente entre la entrada y salida) están alineados con el eje largo del cubierta de vidrio. Presione muy suavemente para asegurar los sellos PDMS contra el vidrio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hornear el dispositivo montado en un horno por al menos 1 h a 60 ° C. Después de la cocción, verificar manualmente que el PDMS es adheridos al vidrio presionando suavemente en una esquina del dispositivo. Nota: Una vez que el dispositivo se enlaza, se debe utilizar dentro de 24 h, como el polímero será cada vez más hidrofóbico con el aumento de tiempo después del tratamiento de plasma.</li>
</ol>3. Preparación-Plomería de microfluidos
<ol><li>Cortar tiras de polímero (diámetro interno (ID) 0.02 pulgadas, diámetro exterior (OD) 0.06 pulgadas) de la tubería en longitudes apropiadas para llegar a de la bomba de jeringa al aparato de conmutación (si se utiliza) y el dispositivo cuando se monta en el microscopio. Cortar tantas tiras como carriles de microfluidos.</li>
	<li>Ensamblar a uniones Y válvulas de manguito (si se usa) por el corte y colocación longitudes de 2 cm de silicona flexible tubo (0,03 pulgadas ID, 0,065 pulgada OD) las lengüetas superiores de la "Y" y longitudes de 1 cm de tubo de silicona a la lengüeta de la parte inferior de la "Y".</li>
	<li>Cortar tiras de 10 cm (o adecuados) de tubería de polímero; unirlos en un extremo para el interruptor de cruce, insertándolos en los segmentos de tubo de silicona de 1 cm de la lengüeta de la parte inferior de la "Y". Conectar en el otro extremo las agujas 21G que se han quitado de sus adaptadores de jeringa de plástico y doblado aproximadamente 90 ° aproximadamente 9 mm desde el extremo de la aguja.</li>
	<li>Conectar agujas embotadas 21G a uno de los extremos de los segmentos de tubería que se desarrollará desde las jeringas al aparato interruptor insertando las agujas en la tubería. Inserte los otros extremos de cada tramo de tubería en los segmentos de tubo de silicona en las barbas de la entrada de las ensambladuras Y. Nota: Usar a algún tipo de aparato para fijar las válvulas de manguito y uniones; Esto puede hacerse fácilmente de una caja de punta de micropipeta (Figura 2D).</li>
	<li>Corte longitudes de tubería de polímero para llevar residuos desde la salida del dispositivo de un vaso de precipitados de residuos. Conecte en un extremo para doblado agujas de 21G, preparado como se describió anteriormente. Con cinta adhesiva el otro extremo de los tubos en un vaso de residuos.</li>
	<li>Preparar volúmenes apropiados de los medios de comunicación que contiene 0,1 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA) y llenar el tamaño y el número de jeringuillas. Conectar las jeringas cargadas de BSA para las agujas de 21G preparado adjunta a las jeringuillas de la tubería y la carga de entrada en las bombas de jeringa. Nota: para los experimentos típicos se utilizan 5 canales del dispositivo, cada uno con una jeringa de 20 mL. Un experimento en el que esté en el medio requiere 2 bancos de 5 jeringas. Aquí, la bomba que contiene el primer banco se conoce como la bomba de la fase 1 y la bomba que contiene el segundo banco, con el interruptor posterior al medio, se conoce como la bomba de la fase 2.</li>
	<li>Purgar el aire de las tuberías de entrada mediante la ejecución de las bombas de jeringa a una velocidad de flujo alta (> 500 μl/min), comenzando por las bombas de jeringa de orientación vertical y golpeando ligeramente la jeringa para hacer burbujas de aire en la parte superior. Una vez que ha sido purgar el aire de las jeringas, coloque la bomba de jeringa horizontalmente y progresivamente tap u hojear las líneas de polímeros de las jeringuillas hasta el aparato conmutador para desalojar las burbujas de aire. Repita este proceso para el segundo banco de jeringas (si el cambio de los medios de comunicación).</li>
	<li>Después se purgan las burbujas de aire, ajustar la bomba de jeringa de fase-2 (es decir, con el medio que se utilizará en segundo lugar, después el interruptor) a 1,5 μl/min, luego hacer una pausa en el flujo. Colocar clips de carpeta pequeño en los segmentos de tubería flexible en la rama de las ensambladuras Y correspondiente a la segunda fase media. Continuar funcionando la bomba de la jeringuilla de la fase 1 con un modesto caudal (por ejemplo, 10 μl/min) durante al menos 30 minutos purgar el segundo medio de la tubería de entrada aguas abajo de la intersección Y.</li>
</ol>4. célula cultura preparación
<ol><li>Crecen durante la noche, planas de la cepa de interés en el medio deseado para la fase estacionaria. La cepa bacteriana debe contener una mutación que hace que las células inmóviles, por lo que las células no bañarse fuera de los canales del dispositivo. Nota: En el presente Protocolo, la cepa bacteriana es B. subtilis 3610 que contiene un hagA233V sustitución (esta mutación hace que el flagelo sea recto en lugar de motilidad celular helicoidal, prevención), un PrsbV- mNeonGreen reportero de células estresadas y constitutiva Phyperspank- mNeptune (rojo) reportero para resaltar celdas. Medio de Lennox LB se utiliza en el protocolo de ejemplo. Las cepas típicas para experimentos de microfluídica contienen uno o más reporteros transcripcionales fluorescentes y una proteína fluorescente constitutivamente producida, citoplásmica para facilitar la detección automatizada de las células. Defectos de crecimiento no fueron observados cuando se utilizó medio rico LB Lennox, pero puede inhibir crecimiento de B. subtilis en medio mínimo bajo condiciones de microfluidos porque secretan sideróforos son arrastrados por el flujo medio. En tales circunstancias, crecimiento puede restaurarse mediante la adición de citrato de sodio y cloruro férrico en el medio, según lo divulgado para S750 medio11.</li>
	<li>La mañana del experimento, diluir las células B. subtilis 1:50 a un desconcertado matraz de 250 mL conteniendo 25 mL de medio de cultivo. Crecen las células para 5-6 h en agitación cultivo a 37 ° C a una densidad óptica de más de 1. Nota: Un cultivo denso celular es preferible porque la fase estacionaria B. subtilis células son más pequeñas y menos con frecuencia encontrados en células cadenas, facilitando la carga de dispositivo. Diferentes especies bacterianas pueden requerir otras condiciones medio o crecimiento de carga óptima.</li>
	<li>Utilizando una jeringa equipada con un filtro de 5 μm tamaño de poro, filtro de aproximadamente 15 mL de cultivo de células en un tubo cónico de 15 mL para eliminar cadenas de células B. subtilis (no es necesaria para e. coli y puede no ser necesario con otras especies). Nota: Deben removerse relativamente pocas células; el filtrado debe ser turbio.</li>
	<li>Centrifugar el filtrado cultura durante 10 min a 4.000 x g a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en el líquido sobrenadante residual restante en el tubo, agregar aproximadamente 500 μl de medio fresco si es necesario para facilitar el pipeteo de la suspensión de células.</li>
</ol>5. dispositivo carga
<ol><li>Suavemente Coloque vacíela fina micropipeta de carga de gel tips (véase Tabla de materiales) en los orificios de salida del dispositivo de microfluidos.</li>
	<li>Utilizando finas puntas de carga de gel con una micropipeta de P200, apaciguar el dispositivo mediante la inyección de medio que contiene 1 mg/mL BSA en los orificios de entrada, observando las puntas en los orificios de salida para controlar el relleno de los canales de microfluidos (figura 2A). Incubar el dispositivo a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. Nota: BSA se utiliza comúnmente como un agente bloqueando o estabilización que se unen a la superficie del polímero PDMS, aumentando su hidrofilicidad y reduciendo la fijación de otras proteínas o de células (a través de moléculas de superficie celular).</li>
	<li>Utilizando finas puntas de gel-cargamento, carga cada canal con el resuspendido células (sección 4), con las puntas en el canal de salida para monitorear el progreso de las células a través del dispositivo (figura 2B). Nota: Carga facilita el ajuste de las Micropipetas P200 a su volumen máximo 200 μl y luego aspirando un cojín de aire antes de aspirar un volumen pequeño (aproximadamente la mitad el volumen de la sección fina de la punta de la pipeta) de las células. El volumen de las células resuspendidos no necesita ser exacto, como el volumen del dispositivo PDMS es pequeño en relación a la de la micropipeta. Conocemos ningún límite superior a la densidad de las células resuspendidas, como la suspensión de células se puede pipetearse en el dispositivo. Grupos de células pueden obstruir el y deben evitarse por pipeteo cuidadoso o vórtice de mezcla.</li>
	<li>Retire suavemente las puntas de carga de gel de los orificios de salida, uno a la vez para evitar daños en el dispositivo de trabajo.</li>
	<li>Centrifugue el dispositivo en una microcentrífuga de sobremesa en un adaptador rotor correspondiente a aproximadamente 6.000 x g por 10 min (figura 2). Nota: Se utilizó un adaptador de rotor de aluminio trabajados a máquina de encargo que fue diseñado para caber en un rotor de microcentrífuga (figura 2); modelos diferentes centrífuga pueden utilizarse con los adaptadores correspondientes del rotor. La característica importante del adaptador es que proporciona fuerza lateral en la dirección de los extremos cerrados de las trincheras de la célula, obligando así a las células en los canales laterales.</li>
	<li>Verificar carga exitosa bajo el microscopio (figura 3) pero sin poner el dispositivo a la escena titular diapositiva insertar. Nota: En este protocolo, un 60 X, 1.4 objetivo de inmersión en aceite NA Ph3 se utiliza para la verificación de ambos en esta etapa y para la proyección de imagen posterior.</li>
</ol>6. montaje, equilibrado y montaje de dispositivo
<ol><li>Montar cuidadosamente el dispositivo cargado en una etapa de inserción con una cinta del vidrio de cubierta en ambos lados de PDMS en la parte inferior de la inserción de la etapa (es decir, invertir el inserto de fase antes de conectar el dispositivo). Invierta la Asamblea de insertar dispositivo de etapa para que el PDMS es hacia arriba y coloque sobre una superficie blanda, como un paño libre de polvo (Figura 2D).</li>
	<li>Ajustar el caudal de la bomba de la jeringuilla de la fase 1 a 35 μl/min trabajando con un carril a la vez, inserte la aguja de entrada y luego la aguja de salida (es decir, que el vaso de precipitados de residuos; Figura 2E).</li>
	<li>Limpie cualquier medio exceso con un trapo limpio libre de polvo y visualmente Inspeccione el dispositivo para fugas. Examinar el tubo de salida para la aparición de células exceso (normalmente aparece como una franja turbia) y el menisco medio, que se moverá lentamente hacia el vaso de precipitados de residuos.</li>
	<li>Permitir que el dispositivo para ejecutar a 35 μl/min durante aproximadamente 15-30 min, hasta que todos los carriles conectados se drenan en el vaso de precipitados de residuos.</li>
	<li>Ajustar la bomba de jeringa de fase 1 a 1,5 μl/min y el flujo de la pausa. Traer todo el aparato de bomba y dispositivo para el microscopio (este proceso es ayudado por colocar todo en un carro rodante) y reiniciar la fase-1 flujo medio en 1,5 μl/min montar cuidadosamente el inserto de la etapa con el dispositivo en un microscopio de fluorescencia invertido, utilizando cinta cuando sea necesario para la entrada y la tubería de salida de la ruta.</li>
	<li>Busque posiciones deseadas en el dispositivo para la proyección de imagen y comienza la proyección de imagen deseada. Tenga en cuenta que las células normalmente requieren unas horas (aproximadamente 10 generaciones) hasta llegar a estado estable fase exponencial crecimiento y puede retrasarse el inicio de la adquisición de la imagen como deseada para que la proyección de imagen comienza después del periodo de equilibrio. Nota: El crecimiento de estado estacionario de células en fase exponencial debe verificarse durante el análisis de la imagen posterior seguimiento tiempos de división celular y asegurando que han alcanzado un valor mínimo constante.</li>
</ol>7. medio de conmutación
<ol><li>Entre las rondas sucesivas de proyección de imagen, hacer una pausa en el flujo de la bomba de la jeringuilla de la fase 1. Cuidadosamente retire los clips de la carpeta de la fase-2 silicona tubo, moviendo cada uno de los tubos de silicona en la rama de fase 1 de la ensambladura Y. Pausa el flujo de la fase 2 la jeringuilla de la bomba (que se estableció en 1,5 μl/min en el paso 3.8) y continuar la proyección de imagen. Nota: A 1,5 μm/min con una longitud de 10 cm de polímero de la tubería aguas abajo de las uniones Y, el medio de la segunda fase llega el dispositivo en aproximadamente 50 minutos. El tiempo para el dispositivo puede probarse empíricamente utilizando los medios que contienen partículas trazadoras fluorescentes.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+an+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li><li>Young, J. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo de la microfluídica es flexible en que muchos de los pasos pueden ser modificados para optimizar su uso con una determinada especie o cepa o para un propósito específico. De hecho, en este protocolo hemos hecho modificaciones a la "máquina de la madre" original concepto de4 para optimizar su uso con B. subtilis. A menudo, las trincheras que se limitan las células constituyen una característica de una sola capa, mientras que en el presente Protocolo utilizan zanjas de ...

Una de las características más llamativas de la vida en la tierra es su gran resistencia y variedad. Una meta central de la biología molecular es comprender la lógica por la que las células utilizan genes y proteínas para maximizar su crecimiento y aptitud bajo una amplia variedad de condiciones ambientales. Para lograr este objetivo, los científicos deben ser capaces de observar con confianza cómo las células individuales crecen, dividirán y expresan sus genes en un conjunto dado de condiciones, observando cómo las células responden a los cambios posteriores en su entorno. Sin embargo, los métodos analíticos tradicionales en Microbiología tienen limitaciones técnicas que afectan los tipos de preguntas que pueden abordarse. Por ejemplo, a granel los análisis basados en la cultura han sido muy útiles en los años, sin embargo, ofrecen sólo datos a nivel de población que pueden enmascarar variaciones significativas de célula a célula o los comportamientos de las subpoblaciones más pequeñas de las células en una población total. Análisis unicelular de bacteria viva basada en microscopía de luz revelan comportamiento unicelular pero también técnicamente limitados. Las bacterias generalmente son inmovilizadas sobre soportes de agarosa que contienen medio de cultivo, pero multitudes de crecimiento y la división de la célula Vista microscópica y agotan los nutrientes disponibles después de pocos ciclos de célula, limitando sustancialmente el tiempo de observación1, 2. Por otra parte, la depleción local de nutrientes y la acumulación concomitante de subproductos metabólicos debido al crecimiento de la célula cambian constantemente el ambiente de crecimiento de célula local en formas que son difíciles de medir o predecir. Tales cambios ambientales usando teclas de agarosa representan un desafío a los estudios de comportamiento de estado estacionario o de respuestas celulares a cambios específicos en las condiciones de crecimiento3.
Tecnología de microfluidos, en el que un medio líquido continuamente es atravesado recientemente dispositivos, ofrece una solución a las limitaciones experimentales clásicos. Un dispositivo microfluídico puede mantener células individuales en posición para microscopía de células vivas, mientras que el flujo del medio de cultivo constante proporciona células con nutrientes frescos y remueve exceso células, creando así un crecimiento más uniforme y subproductos metabólicos medio ambiente. En condiciones de constante crecimiento, se observan comportamientos celulares en aislamiento de la influencia de factores ambientales, que permite una vista sin obstáculos de la lógica interna de las células. Como el fluido evita que el dispositivo de microfluidos cada vez lleno de células, observación de los linajes de la célula para decenas o cientos de generaciones se convierte en posible4,5. Los tiempos de observación largos permiten la detección de comportamientos de otra manera imperceptible celular a largo plazo o rara. Finalmente, la composición del medio que fluye a través del dispositivo puede modificarse a voluntad, permitiendo que las células a observar como responden a la aparición de un estrés o a la introducción o extracción de un compuesto particular.
Microfluídica ya ha disfrutado de una serie de aplicaciones importantes. Por ejemplo, se ha utilizado en tejido, órgano o cuerpo-en-un-chip de dispositivos, en el que varios tipos de células humanas se cultivan conjuntamente para simular un en vivo condición6; para el estudio de nematodos movimiento en entornos microestructurada7; examinar las interacciones entre biopelículas bacterianas (p. ej., 8); y para la encapsulación y la manipulación de volúmenes pequeños de las células o sustancias químicas (p. ej., 9). Dispositivos microfluídicos también han hecho cada vez más populares en el campo de la microbiología (por excelentes críticas, véase 10 y 11), especialmente como su físico y las propiedades de flujo son bien emparejados a nichos microbianos naturales12. Por ejemplo, microfluídica ha sido recientemente empleada por microbiólogos para tales fines como célula crecimiento y la división13,14,15, análisis de movimiento del patógeno16, que mide precisamente control de detección de quórum17 y18de las transiciones fisiológicas y para la proteína contando19, entre muchos otros ejemplos. El método presentado aquí está diseñado específicamente para el análisis de los linajes de la célula bacteriana en lugar de combinaciones de cepas o especies. El dispositivo de microfluidos demostrado aquí utiliza una variación de la "máquina de la madre" diseño4, en el cual las células se cultivan solo archivo dentro de una zanja de microfluidos con un extremo cerrado y un extremo abierto; División y crecimiento celular empuja a las células de la progenie arriba y hacia afuera el extremo abierto en el fluido. Los análisis suelen centran sólo en la célula "madre" que se limita en el extremo cerrado de la zanja. Consideramos este método como un adelanto sobre anteriores luz basadas en microscopia sola célula técnicas analíticas, tales como inmovilización de células en agarosa almohadillas. Mientras que B. subtilis se utiliza como un modelo, el método es también aplicable a otras especies bacterianas (Escherichia coli es otro modelo común, algunas especies con células diferentes tamaños y morfologías pueden requerir la fabricación de nuevos dispositivos con diferentes dimensiones). El uso de reporteros fluorescentes para marcar las células y visualizar los cambios en la expresión génica requiere el uso de especies genéticamente manejables; sin embargo, los análisis de morfología y crecimiento de la célula son posibles incluso sin marcadores fluorescentes.
El presente Protocolo excluye el proceso de fabricación del maestro de silicio mediante Fotolitografía, que ha sido ampliamente descrito en otra parte5; maestros también pueden ser fácilmente subcontratados de microfabricación instalaciones. Incluye el moldeado de un dispositivo PDMS de un maestro de silicio reforzada; vinculación el dispositivo a un pedazo de vidrio de la cubierta; montaje de la entrada de microfluidos y tubería de salida, válvulas de pellizco incluido para permitir el cambio de medio; apaciguando el dispositivo, preparar células bacterianas y cargar el dispositivo con las células bacterianas; al conectar las tuberías para el dispositivo y equilibra las células; y cargar el dispositivo en un microscopio de fluorescencia para la proyección de imagen. Porque muchos de imagen diferente de adquisición y procesamiento software herramientas pueden utilizarse para visualizar y analizar diferentes datos de interés4,5, se muestran imágenes de ejemplo, pero los métodos de captura de imagen no están incluidos en este protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">(240)4019862</td>
			<td style="width:167px;">This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">0.75-mm biopsy punch</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">22 x 40 mm No. 1.5 cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48393 172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Plasma Etch PE-50</td>
			<td style="width:71px;">Plasma Etch Inc.</td>
			<td style="width:119px;">PE-50</td>
			<td>Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Tygon flexible tubing ID 0.02&#34;, OD 0.06&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Saint-Gobain PPL Corp.</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:223px;">Silicone Tubing, 0.04&#34; ID, 0.085&#34; OD</td>
			<td style="width:71px;">HelixMark Standard Silicone Tubing</td>
			<td style="width:119px;">60-795-05</td>
			<td>For pinch valves and Y-junction connection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906-100G</td>
			<td>Used as passivation agent</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">ART Gel Pipet Tips (P200)</td>
			<td style="width:71px;">Molecular BioProducts</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2155</td>
			<td>For loading the device with medium and cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-&#956;m Supor membrane</td>
			<td style="width:71px;">Pall Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4560</td>
			<td>For filtering cultures before device loading</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">21-ga blunt needles, 1&#34;</td>
			<td style="width:71px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">75165A681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Y connector with 200-series barbs, 1/16&#34; ID tubing, polypropylene</td>
			<td style="width:71px;">Nordson Medical</td>
			<td style="width:119px;">Y210-6005</td>
			<td>The company is AKA Value Plastics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">LB Lennox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right">367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Bacillus subtilis strain NCIB3610</td>
			<td style="width:71px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:119px;">3A1</td>
			<td>wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gravity convection oven</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">414005-106</td>
			<td>for curing PDMS and baking assembled devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scotch-Weld Epoxy Kit</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">2216 B/A</td>
			<td>may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scotch Magic tape, 3/4&#34; width</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted &#34;office tape&#34; or &#34;adhesive tape&#34; in protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ800N</td>
			<td>listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W292907</td>
			<td>To clean cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Syring pump, 6 channel</td>
			<td style="width:71px;">New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td>a brand of dust-free wipes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis

Tecnología de microfluidos supera muchas de las limitaciones a los métodos analíticos tradicionales en Microbiología. A diferencia de los métodos de cultivo a granel, ofrece resolución de unicelular y observación larga épocas que abarca cientos de generaciones; a diferencia de agarosa microscopia basada en pad, tiene condiciones de crecimiento uniforme que pueden ser bien controladas. Porque el continuo flujo de medio de cultivo aísla las células en un dispositivo de microfluidos de variaciones impredecibles en el ambiente químico local causado por el crecimiento celular y metabolismo, auténticos cambios en la expresión génica y crecimiento celular en respuesta a estímulos específicos pueden observarse con más confianza. Bacillus subtilis se utiliza aquí como una especie bacteriana de modelo para demostrar una "máquina de la madre"-tipo de método para el análisis celular. Mostramos cómo construir vertical un dispositivo de microfluidos, cargar con las células, iniciar la proyección de imagen microscópica y exponer las células a un estímulo por la conmutación de un medio a otro. Un reportero sensible al estrés se utiliza como ejemplo para revelar el tipo de datos que pueden obtenerse por este método. También discutimos brevemente más aplicaciones de este método para otros tipos de experimentos, tales como análisis de esporulación bacteriana.

Acertado de la célula inicial de carga, según lo determinado por microscopía de contraste de fase antes de conectar las tuberías de microfluidos al dispositivo, se consideraría que todos o casi todos los canales laterales de microfluidos que contiene una o más células bacterianas ( Figura 3A). Carga óptima mostraría varias células en cada canal y canales, sin embargo, se llenarán de células debido al crecimiento de la célula durante el período d...

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Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Biology

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

11.9K vistas.  Oklahoma State University. Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.

Video: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Investigación

Biología

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Transfección de células individuales en embriones de pollo

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

La microinyección de una sola célula de Análisis de Comunicación Móvil

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Aplicaciones de la sonda: Single-Imaging espectrometría de masas y análisis de celda única bajo condiciones ambientales

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Investigar los efectos perjudiciales de baja presión Plasma esterilización sobre la supervivencia de vivir el Bacillus subtilis esporas usando el celular microscopia

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...