Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción virus-huésped sobre cómo establecer eficazmente una infección viral en Drosophila melanogaster. Este método de nanoinyección permite un control preciso de la dosis de infección del virus y se puede aplicar fácilmente a las infecciones con otros patógenos microbianos. Comience creciendo una vez 10 a las séptimas células estelares S2 viables por mililitro como monocapa suelta y semiadherencia en un plato de cultivo celular de 10 centímetros con 10 mililitros de Drosophila Medium completo de Schneider sin dióxido de carbono adicional a 25 grados Celsius durante una hora.
Durante la incubación, resuspender virus Drosophila C o DCV recién descongelado a una multiplicidad de infección de 0,01 en un mililitro de medio completo y añadir solución de virus a los platos de cultivo celular. A continuación, devuelva la placa a la incubadora de 25 grados Centígrados durante tres a cinco días. El virus está listo para su recolección cuando la morfología celular se ve borrosa y el medio de cultivo está lleno de partículas negras indicativas de desechos celulares.
Mezclar el sobrenadante pipeteando unas cuantas veces antes de transferir todo el cultivo celular a un tubo de 15 mililitros para la lelisis de las células huésped a menos 80 grados centígrados. Para generar concentraciones de trabajo de virus, descongele la suspensión celular en un baño de agua de 25 grados Celsius con agitación constante antes de peletizar los desechos celulares por centrifugación. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo estéril de 15 mililitros para vórtice y alícuota hasta 200 microlitros de solución de virus por tubo.
Para determinar la dosis infecciosa promedio de cultivo del tejido del virus, primero se siembra una por 10 a las cinco células estelares S2 en 100 microlitros de medio completo en ocho pozos por columna en 12 filas de una placa de 96 pozos. A continuación, vuelva a la placa a la incubadora de 25 grados Centígrados. Seleccione aleatoriamente cinco tubos de virus de menos 80 grados Celsius almacenamiento.
Mientras las células se asientan, llene 10 tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 450 microlitros de medio completo estéril y agregue 50 microlitros de stock de virus al primer tubo de 1,5 mililitros que contenga 450 microlitros de medio estéril completo diluyendo las suspensiones 10 veces por paso al pozo 12. Al final de la incubación, añadir 50 microlitros de cada dilución al pozo adecuado en cada columna para ese tubo de virus y añadir 50 microlitros de medio de cultivo sin virus a uno bien por columna como pozo de control negativo. A continuación, coloque la placa en la incubadora de 25 grados Celsius durante tres días y evalúe el efecto citopático de cada población de virus bajo un microscopio Brightfield con un aumento de 20X diario.
Clasificar un pozo en el que las células se ven borrosas y el medio está lleno de fragmentos como un pozo positivo y un pozo en el que la morfología celular es normal como un pozo negativo. Antes de la cría, mezcle a fondo 400 microlitros de 50 microgramos por mililitro de Tetraciclina con cuatro gramos de alimentos frescos para moscas de la harina de maíz estándar y coloque el alimento a cuatro grados centígrados durante la noche para evaporar el etanol. A la mañana siguiente, calienta los alimentos a temperatura ambiente y coloca los alimentos y 20 hembras y 10 machos recién cerrados moscas adultas en un vial de cría para una incubación de cría de tres a cuatro días a 25 grados centígrados y 60% de humedad bajo un ciclo normal de luz/oscuridad.
Cuando se hayan puesto suficientes huevos, recoger las moscas adultas recién cerradas bajo un flujo de luz de dióxido de carbono y reproducir la Drosophila de nuevo dos veces más como se acaba de demostrar. Después de tres generaciones de tratamiento de Tetraciclina, recoger cinco moscas bajo un flujo de luz de dióxido de carbono y homogeneizar las moscas con 250 microlitros de agua destilada doble y unas pocas cuentas de cerámica estéril de 0,5 milímetros. Después de un minuto, agregue 250 microlitros de 2X Buffer A a la muestra para vórtice antes de congelar las muestras a menos 80 grados Centígrados.
A continuación, descongela rápidamente las muestras de menos 80 grados Celsius de almacenamiento en un baño de agua de 25 grados Celsius, seguido de una incubación de 30 minutos en un baño de agua de 70 grados Celsius antes de extraer el ADN genómico y amplificar el ADN por reacción en cadena de la polimerasa de acuerdo con los protocolos estándar. Confirmar la ausencia de Wolbachia 16 ARN pequeño y wsp en cada mosca homogeneada por electroforesis de gel de acuerdo con los protocolos estándar. A continuación, reta el stock de mosca libre de Wolbachia en alimentos de mosca de harina de maíz estándar como se demuestra.
Para la infección viral, utilice primero un estereomicroscopio y fórceps delgados para romper la punta de una aguja capilar de vidrio al diámetro adecuado para la nanoinyección. Para montar el inyector, coloque la junta tórica del techo y un espaciador blanco en el émbolo metálico del inyector con el gran hoyuelo orientado hacia afuera. Utilice una jeringa equipada con una aguja de calibre 30 para llenar la aguja de vidrio con aceite mineral y colocar la aguja a través del cuello.
Coloque la junta tórica más grande alrededor de la base del collar a aproximadamente un milímetro del extremo romo de la aguja y monte la aguja en el émbolo del inyector. Fije la aguja en el émbolo y presione el botón vacío para extender el émbolo del microinyector hasta que se oeje una señal audible. Ahora presione fill para retraer el émbolo cinco milímetros y sumerja la aguja en una suspensión viral de la unidad de formación de placa de 100.
Agitar suavemente uno o al menos tres viales de 20 Drosophila macho sin Wolbachia sobre el plato de inyección. Las moscas dotadas masculinas son preferidas durante el apareamiento y la reproducción puede influir en las hembras. A continuación, inyecte el tórax de cada mosca con 50,6 nanolitros de solución de virus en la región de color ligeramente más claro entre la mesopleura y la pteropleura y mida la carga de DCV mediante ensayo de efecto citopático y PCR RT cuantitativo de moscas terrestres como se acaba de demostrar.
Después de la inyección, transfiera cuidadosamente las moscas a un vial fresco y coloque el vial en una posición horizontal para evitar que las moscas se peguen al medio mientras se recuperan de la anestesia. La inyección consume mucho tiempo, pero la replicación de DCV es muy rápida, por lo que es muy importante anotar el tiempo exacto en el tubo una vez que se han inyectado todas las moscas de cada vial. La infección por virus puede inducir la lelisis celular y se observan efectos citopáticos a los tres días después de la infección.
Wolbachia 16s rRNA y wsp primers se pueden utilizar para detectar la presencia de Wolbachia y Drosophila como se demuestra. Las moscas libres de Wolbachia exhiben una tasa de supervivencia significativamente disminuida después de la infección por EL VPH y de una manera dependiente de la dosis. El DCV activa las vías de señalización antiviral en el huésped que son críticas para la infección antiviral en Drosophila como lo demuestra la disminución de la tasa de supervivencia y el aumento de la carga viral en las moscas mutantes Dicer-2.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la contaminación con Wolbachia genotipo puede afectar la susceptibilidad de la Drosophila melanogaster vuela a la infección por EL DCV. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como una pantalla genética a mayor escala para responder preguntas adicionales sobre genes huésped poco definidos necesarios para la infección viral o las respuestas antivirales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad viral humana exploraran los mecanismos subyacentes a los brotes de infecciones virales humanas endémicas en el modelo Drosophila melanogaster.
No olvide que trabajar con virus puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso del equipo de protección adecuado durante la realización de este procedimiento.
