Este protocolo aborda el análisis de muestras limitadas obtenidas de los microbiorres para extraer información vital sobre los atributos críticos de calidad de los productos. Otra ventaja de estas técnicas es que utilizan tiempos mínimos de análisis para determinar los atributos clave que dictan los parámetros de calidad del producto fabricado. El procedimiento de demostración serán David Powers, Talia Faison y Phillip Angart, becarios de investigación de mi laboratorio.
Comience abriendo el software conectado al sistema de purificación y colocando tubos cónicos de 15 mililitros para recoger el eluido de anticuerpos purificados y tubos cónicos de 50 mililitros para recoger el flujo durante el lavado de alta sal en el colector de fracción. A continuación, agregue un líquido de cultivo celular cosechado filtrado de 0,22 micrómetros a una jeringa vacía de 12 mililitros con una boquilla tapada. Después de retirar la tapa, inserte la boquilla de la jeringa en el puerto de inyección manual del sistema de purificación.
Gire la jeringa para apretarla en su lugar y presione el émbolo hasta que se haya inyectado todo el volumen de la muestra y sea visible en el bucle de muestra de gran volumen de 10 mililitros adjunto. Seleccione el método guardado y haga clic en Ejecutar cuando se lo solicite el software del instrumento. Cuando todo el anticuerpo haya sido eludido, neutralice inmediatamente la proteína purificada con una base de tris molar a un pH de aproximadamente 5,5.
Para concentrar el anticuerpo purificado por centrifugación, coloque filtros de 100 kilodalton en tubos de recogida de filtrados. Lave los filtros con 500 microlitros de agua doble destilada y luego centrífugo. Repita el lavado del filtro dos veces.
Después del segundo lavado, deseche el filtrado y transfiera los filtros enjuagados a nuevos tubos de centrífuga. A continuación, añada 500 microlitros de muestra a cada filtro para la centrifugación. Al final del giro, invierta el filtro en un nuevo tubo de recogida para obtener la muestra concentrada con una centrifugación final.
Para el etiquetado y aislamiento de N-glycan, diluya 7,5 microlitros de cada muestra de anticuerpos concentrados. Con 15,3 microlitros de espectrometría de masas de cromatografía líquida o agua de grado LCMS en tubos de un mililitro del kit, y desnaturalizar los anticuerpos con seis microlitros de una solución del 5% de un tensioactivo amigable con las enzimas y la espectrometría de masas a 90 grados centígrados durante tres minutos. Al final de la desnaturalización, deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante tres minutos antes de agregar 1,2 microlitros de péptido N-glucoosidasa F para una incubación de cinco minutos a 50 grados centígrados.
Después de enfriar las muestras durante tres minutos a temperatura ambiente, etiquete las muestras con 12 microlitros de reactivo de etiquetado fluorescente disuelto en dimetilformamida anhidra durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, diluir la mezcla de N-glicano etiquetada con 358 microlitros de acetonitrile y colocar una placa de cromatografía de interacción hidrófila en un colector de vacío con calzas y bandeja de residuos. Acondicionar los pozos con 200 microlitros de agua con el vacío ajustado a 10 a 15 kilopascales para asegurar que el líquido tardará de 15 a 30 segundos en pasar a través de la resina cromatográfica de interacción hidrófila.
Equilibrar los pozos con 200 microlitros de 85%acetonitrilo durante 15 a 30 segundos antes de cargar 400 microlitros de cada mezcla de glicano etiquetado a cada pozo, aplicando el vacío después de cada nuevo líquido se añade. Una vez añadidas todas las muestras, lave la resina dos veces con 600 microlitros de 1% de ácido fórmico y 90%acetonitrilo por lavado y reemplace la bandeja de residuos con tubos de recogida de 600 microlitros. A continuación, elude los N-glicanos etiquetados con tres volúmenes de 30 microlitro de tampón de elución de espectrometría y diluya las diluciones de la piscina con 310 microlitros de dimetilformamida en eluyente muestreado de acetonitrilo.
Para analizar las muestras de elución N-glycan etiquetadas en un sistema de cromatografía líquida de ultraperforma acoplado a un detector de fluorescencia y el tiempo cuádruple del espectrómetro de masa de vuelo, utilice 50 forma de amonio milimolar y acetonitrilo de grado 100%LCMS para las fases móviles. Establezca el caudal inicial en 0,4 mililitros por minuto, con el gradiente LC que proporciona un aumento del formate de amonio durante la fase de elución. Ajuste el detector de fluorescencia para medir una excitación de 265 nanómetros y una emisión de 425 nanómetros con una frecuencia de muestreo de dos hercios.
Establezca el tiempo cuádruple de vuelo al modo de sensibilidad iónica MS1-positivo con un rango de masa de 100 a 2.000 Daltons, un tiempo de escaneo de 0,25 segundos y una adquisición de datos continuo. A continuación, cargue las muestras en el conjunto de muestreador automático en 10 grados Celsius y ejecute el método cargado. Para desalgar una muestra en preparación para el análisis de variantes de carga, desprenda el tapón inferior de una columna de desalado de 0,5 mililitros, afloje el tapón superior y coloque la columna de desalado en un tubo centrífugo de 1,7 mililitros.
Transfiera la nueva columna a un nuevo tubo de microcentrífuga y añada 80 microlitros de una solución de anticuerpos de 3,5 miligramos por mililitro a la parte superior de la columna. Alinee la columna con la orientación original y centrifugar la columna. A continuación, deseche la columna de desalado y mezcle a fondo la muestra concentrada.
Diluir la muestra a una concentración de dos miligramos por mililitro en 25 microlitros de agua ultrapura en un solo pozo de una placa de 96 pozos y añadir cinco microlitros de tampón de etiquetado y cinco microlitros de reactivo de etiquetado al pozo. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz, mezcle 60 microlitros de agua de grado reactivo con la muestra y cubra la placa con un sello de placa para la centrifugación. Para preparar el chip de la variante de carga, retire la solución de almacenamiento y lave los pozos uno, tres, cuatro, siete, ocho y 10 con agua.
Sustituya el agua por un tampón de corriente pH 7.2 y añada 750 microlitros de tampón de funcionamiento al tubo tampón. Pulse Placa de descarga en la interfaz de usuario del instrumento y retire el sello de la placa de 96 pozos. Inserte la placa y el tubo tampón en los puntos indicados en la bandeja de muestra GX2 y pulse Cargar placa.
Coloque el chip en la cámara de viruta, cierre la tapa de la cámara de viruta, seleccione el ensayo de variante de carga de proteína HT cuando se le solicite y haga clic en Ejecutar. La purificación de la muestra de cultivo celular cosechada del biorreactor automatizado a microescala mediante cromatografía líquida proteica rápida permite caracterizar los atributos críticos de calidad de las proteínas purificadas mediante diversos métodos analíticos posteriores, como se ha demostrado. Los datos de N-glicanos de anticuerpos monoclonales producidos por el ovario de hámster chino procesados por espectrometría de masas deben parecer similares a estos cromatogramas representativos.
La cromatografía de exclusión de tamaño se puede utilizar para evaluar el perfil de agregación y el peso molecular del anticuerpo. La pequeña cantidad de muestra y la importancia de la agregación son atributos críticos de calidad para hacer de esta técnica una herramienta analítica complementaria muy valiosa para el sistema de microbiorreo automatizado. El resultado de la electroforesis de zona micro capilar es un electroferograma y se puede utilizar para mostrar el perfil de variante de carga de un anticuerpo monoclonal, una firma única para la proteína que se está investigando que es altamente sensible al pH de funcionamiento.
El consumo de aminoácidos también se puede controlar para determinar si el agotamiento causa cambios en los atributos críticos de calidad del anticuerpo. Es importante garantizar una purificación adecuada y eficiente del producto fabricado, ya que los pasos analíticos sólo pueden llevarse a cabo con una proteína debidamente purificada. El producto también puede ser sometido a mapeo de péptidos y pruebas de estabilidad.
Pero una vez que la proteína se ha utilizado para un método de caracterización, por lo general no se puede utilizar para otro. Estas técnicas permiten el análisis de productos producidos a partir de plataformas de cribado de bioprocesamiento de pequeño volumen y alto rendimiento para comprender la influencia de los parámetros de bioprocesamiento en la calidad del producto. Algunas de estas técnicas utilizan ácido perclórico concentrado, ácido fórmico, N-dimetilformamida, todos los cuales son peligrosos y deben ser manejados cuidadosamente mientras se usa el equipo de protección adecuado.
