Dieses Protokoll befasst sich mit der Analyse begrenzter Proben, die aus Mikrobioreaktoren gewonnen wurden, um wichtige Informationen über die kritischen Qualitätsmerkmale der Produkte zu extrahieren. Ein weiterer Vorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie minimale Analysezeiten verwenden, um die Wichtigstenattribute zu bestimmen, die die Qualitätsparameter des hergestellten Produkts diktieren. Demonstrierend werden David Powers, Talia Faison und Phillip Angart, Forschungsstipendiaten aus meinem Labor sein.
Beginnen Sie mit dem Öffnen der Software, die an das Reinigungssystem angeschlossen ist, und legen Sie 15 Milliliter konische Rohre, um den gereinigten Antikörper eluat eluat und 50 Milliliter konische Rohre zu sammeln, um den Durchfluss während der hohen Salzwäsche in den Fraktionensammler zu sammeln. Als nächstes fügen Sie 0,22 Mikrometer Poren gefilterte geerntete Zellkulturflüssigkeit zu einer leeren 12-Milliliter-Spritze mit einer gekappten Düse hinzu. Nach dem Entfernen der Kappe die Spritzendüse in den manuellen Injektionsanschluss des Reinigungssystems einlegen.
Drehen Sie die Spritze, um sie an Ort und Stelle zu ziehen, und drücken Sie den Kolben, bis das gesamte Volumen der Probe injiziert wurde und in der beigefügten 10 Milliliter großen Probenschleife sichtbar ist. Wählen Sie die gespeicherte Methode aus, und klicken Sie auf Ausführen, wenn Sie von der Instrumentensoftware dazu aufgefordert werden. Wenn der gesamte Antikörper entglüht ist, neutralisieren Sie das gereinigte Protein sofort mit einer Molarentrisbasis auf einen pH-Wert von etwa 5,5.
Um den gereinigten Antikörper durch Zentrifugation zu konzentrieren, legen Sie 100 Kilodaltonfilter in Filtrat-Sammelrohre. Waschen Sie die Filter mit 500 Mikroliter doppeldestilliertem Wasser, dann Zentrifuge. Wiederholen Sie die Filterwäsche zweimal.
Nach dem zweiten Waschen das Filtrat entsorgen und die gerederten Filter in neue Zentrifugenrohre übertragen. Als Nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Probe zu jedem Filter für die Zentrifugation hinzu. Am Ende der Drehung den Filter in ein neues Sammelrohr umkehren, um die konzentrierte Probe mit einer abschließenden Zentrifugation zu erhalten.
Zur N-Glyglykan-Etikettierung und Isolierung 7,5 Mikroliter jeder konzentrierten Antikörperprobe verdünnen. Mit 15,3 Mikroliterflüssigchromatographie-Massenspektrometrie oder LCMS-Wasser in Ein-Milliliter-Röhren aus dem Kit und Denaturierung der Antikörper mit sechs Mikrolitern einer 5%-Lösung eines enzym- und massenspektrometriesfreundlichen Tensids bei 90 Grad Celsius für drei Minuten. Am Ende der Denaturierung lassen Sie die Proben drei Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie 1,2 Mikroliter Peptid N-Glykosidase F für eine fünfminütige Inkubation bei 50 Grad Celsius hinzufügen.
Nachdem Sie die Proben drei Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt haben, beschriften Sie die Proben mit 12 Mikrolitern fluoreszierendem Tagging-Reagenz, das in wasserfreiem Dimethylformamid bei Raumtemperatur gelöst ist. Am Ende der Inkubation die markierte N-Glykan-Mischung mit 358 Mikroliter Acetonitril verdünnen und eine hydrophile Wechselwirkungschromatographieplatte in einen Vakuumkrümmer mit Schimsen und Abfallschale legen. Konditionieren Sie die Brunnen mit 200 Mikroliter Wasser mit dem Vakuum auf 10 bis 15 Kilopascal eingestellt, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit 15 bis 30 Sekunden dauert, um das hydrophile Interaktionschromatographieharz zu passieren.
Die Brunnen mit 200 Mikrolitern 85%Acetonitril für 15 bis 30 Sekunden ausstatten, bevor 400 Mikroliter jedes markierten Glykangemischs auf jeden Brunnen geladen werden, wobei das Vakuum nach dem Zuführen jeder neuen Flüssigkeit aufgebracht wird. Wenn alle Proben zugegeben sind, waschen Sie das Harz zweimal mit 600 Mikroliter1%Ameisensäure und 90%acetonitril pro Waschgang und ersetzen Sie die Abfallwanne durch 600-Mikroliter-Sammelrohre. Dann entziehen Sie sich den beschrifteten N-Glykanen mit drei 30-Mikroliter-Volumen Spektrometrie-Elutionspuffer und verdünnen Sie die Beckenverdünnungen mit 310 Mikroliter Dimethylformamid in Acetonitex-Probeeluent.
Um die beschrifteten N-Glykan-Elutionsproben auf einem ultraleistungsfähigen Flüssigchromatographiesystem zu analysieren, das an einen Fluoreszenzdetektor gekoppelt ist, und die vierfache Zeit des Flugmassenspektrometers verwenden Sie 50 Millimolar Ammoniumformat und 100%LCMS-Acetonitril für die mobilen Phasen. Legen Sie den anfänglichen Durchfluss auf 0,4 Milliliter pro Minute fest, wobei der LC-Gradient während der Elutionsphase ein zunehmendes Ammoniumformat bietet. Stellen Sie den Fluoreszenzdetektor ein, um eine Anregung von 265 Nanometern und eine Emission von 425 Nanometern mit einer Abtastrate von zwei Hertz zu messen.
Stellen Sie die vierfache Flugzeit auf den MS1-positiven Ionenempfindlichkeitsmodus mit einem Massenbereich von 100 bis 2 000 Daltons, einer Scanzeit von 0,25 Sekunden und einer Kontinuumsdatenerfassung ein. Laden Sie dann die Samples in den auf 10 Grad Celsius eingestellten auto Sampler, und führen Sie die geladene Methode aus. Um eine Probe in Vorbereitung auf die Ladungsvariantenanalyse zu entsalzen, schnappen Sie den unteren Stopfen einer 0,5 Milliliter Entsalzungssäule ab, lösen Sie den oberen Stopfen und legen Sie die Entsalzungssäule in ein 1,7 Milliliter Zentrifugenrohr.
Übertragen Sie die neue Säule in ein neues Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie 80 Mikroliter einer 3,5 Milligramm pro Milliliter Antikörperlösung an die Oberseite der Säule. Richten Sie die Spalte an der ursprünglichen Ausrichtung aus, und zentrieren Sie die Spalte. Dann entsorgen Sie die Entsalzungssäule und mischen Sie die konzentrierte Probe gründlich.
Verdünnen Sie die Probe auf eine Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter in 25 Mikroliter Reinstwasser in einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte und fügen Sie fünf Mikroliter Etikettierpuffer und fünf Mikroliter Etikettierungsreagenz in den Brunnen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Lichtschutz bei Raumtemperatur 60 Mikroliter Reagenzwasser mit der Probe mischen und die Platte mit einer Plattendichtung für die Zentrifugation bedecken. Um die Ladung Variante Chip vorzubereiten, entfernen Sie die Speicherlösung und waschen Brunnen eins, drei, vier, sieben, acht und 10 mit Wasser.
Ersetzen Sie das Wasser durch pH 7.2-Laufpuffer und fügen Sie dem Pufferrohr 750 Mikroliter Laufpuffer hinzu. Drücken Sie auf der Benutzeroberfläche des Geräts die Entladeplatte und entfernen Sie die Dichtung von der 96-Well-Platte. Setzen Sie die Platte und das Pufferrohr in die angegebenen Stellen auf dem GX2-Probenfach ein und drücken Sie Die Lastplatte.
Legen Sie den Chip in die Chipkammer, schließen Sie den Deckel an der Chipkammer, wählen Sie den HT-Proteinladungsvariantentest aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden, und klicken Sie auf Ausführen. Die Reinigung der geernteten Zellkulturprobe aus dem automatisierten Mikroskalen-Bioreaktor durch schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie ermöglicht die Charakterisierung der kritischen Qualitätsmerkmale der gereinigten Proteine durch verschiedene nachgelagerte Analysemethoden, wie gezeigt. N-Glykan-Daten von chinesischen Hamster-Ovarial-produzierten monoklonalen Antikörpern, die durch Massenspektrometrie verarbeitet werden, sollten diesen repräsentativen Chromatogrammen ähnlich erscheinen.
Größenausschlusschromatographie Multiple-Winkel-Lichtstreuung kann verwendet werden, um das Aggregationsprofil und das Molekulargewicht des Antikörpers zu bewerten. Die geringe Menge der Probe und die Bedeutung der Aggregation sind wichtige Qualitätsmerkmale, um diese Technik zu einem sehr wertvollen ergänzenden Analysewerkzeug zum automatisierten Mikrobioreaktorsystem zu machen. Das Ergebnis der Mikrokapillarzonenelektrophorese ist ein Elektropherogramm und kann verwendet werden, um das Ladungsvariantenprofil für einen monoklonalen Antikörper zu zeigen, eine einzigartige Signatur für das untersuchte Protein, das hochempfindlich auf den betriebsbereiten pH-Wert reagiert.
Der Aminosäureverbrauch kann auch überwacht werden, um festzustellen, ob die Erschöpfung Veränderungen in den kritischen Qualitätsmerkmalen des Antikörpers bewirkt. Es ist wichtig, eine ordnungsgemäße und effiziente Reinigung des hergestellten Produkts zu gewährleisten, da die analytischen Schritte nur mit einem ordnungsgemäß gereinigten Protein durchgeführt werden können. Das Produkt kann auch Peptid-Mapping und Stabilitätstests unterzogen werden.
Aber sobald das Protein für eine Charakterisierungsmethode verwendet wurde, kann es in der Regel nicht für eine andere verwendet werden. Diese Techniken ermöglichen die Analyse von Produkten, die aus Bioverarbeitungsplattformen mit geringem Volumen und hohem Durchsatz hergestellt werden, um den Einfluss von Bioverarbeitungsparametern auf die Produktqualität zu verstehen. Einige dieser Techniken verwenden konzentrierte Perchlorsäure, Ameisensäure, N-Dimethylformamid, die alle gefährlich sind und sorgfältig behandelt werden sollten, während sie die richtige Schutzausrüstung tragen.
