Este protocolo se puede utilizar para detectar el efecto de múltiples enzimas de glicosilación en el perfil glicosilado de una proteína objetivo y contribuir a una mejor comprensión de las funcionalidades de la enzima. La naturaleza del protocolo permite el cribado de enzimas de glicosilación de una manera transitoria, pero de alto rendimiento. Los perfiles de glicosilación alterados pueden conducir a una mejora de las actividades de anticuerpos y, por lo tanto, aumentar la eficacia del producto final.
Las compañías biofarmacéuticas monitorean de cerca la glicosilación como un atributo crítico de calidad. Una glicosilación aberrante es un sello distintivo de enfermedades como el cáncer. Por lo tanto, este método es relevante para la investigación farmacológica y biomédica.
El protocolo asume que los usuarios tienen experiencia en varias técnicas experimentales, incluida la transfección de células de mamíferos y Western blots. Es mejor comenzar con menos muestras y usar puntos de parada en primera instancia. Comience por evaluar la densidad y la viabilidad de las células de ovario de hámster chino.
Luego, limpie cuidadosamente el gabinete de bioseguridad y todo el equipo con etanol al 70% y una solución inhibidora de la RNasa para evitar la contaminación. A continuación, peletizar las células a 100 veces G durante cinco minutos y volver a suspenderlas en un medio precalentado a una densidad celular de cinco veces 10 a las seis células por mililitro. Transfiera ocho microlitros de la mezcla maestra de DsiRNA o control a una cubeta de electroporación estéril.
Agregue 800 microlitros de la suspensión de la celda a la misma cubeta, mezcle y entregue el pulso de electroporación. Luego, transfiera la suspensión celular de la cubeta a un pocillo de una placa de seis pocillos, evitando el material similar a la espuma. Incubar las células durante 10 minutos sin agitar.
Después de la incubación, agregue 800 microlitros de medios precalentados para hacer un volumen final de 1.6 mililitros por pozo. Cultive las células transfectadas en la incubadora mientras agita a 150 RPM. Después de 48 horas, cosecha el sobrenadante y las células.
Después de la purificación de IgG, agregue la elución A a un concentrador centrífugo de corte de peso molecular de tres kilodalton y centrífique a 13, 300 veces G durante 40 a 50 minutos a cuatro grados Celsius. La centrifugación se completa una vez que el volumen residual es igual o inferior a 50 microlitros. Deseche el flujo continuo y agregue 500 microlitros de PBS 1X preenfriado para diluir el sobrenadante residual.
Centrifugar la muestra de nuevo utilizando las mismas condiciones hasta que queden 50 microlitros de sobrenadante residual. Para obtener una dilución de 100X del sobrenadante, agregue 500 microlitros de PBS 1X preenfriado y repita el proceso de centrifugación. Concentre el sobrenadante en una concentración final de aproximadamente 2,5 gramos por litro en 40 microlitros para garantizar la compatibilidad con el método de análisis de glicanos.
Para el análisis de glicanos, transfiera 200 microlitros de la solución de perla magnética a un tubo de PCR de 2 mililitros. Colóquelo en el soporte magnético para separar las cuentas del sobrenadante y retire el sobrenadante con cuidado. Luego, retire los tubos del soporte magnético y agregue la muestra de proteína purificada y el vórtice.
A continuación, agregue el tampón de desnaturalización de suministro al tubo de muestra e incube durante ocho minutos a 60 grados centígrados. Mantenga los tubos de muestra abiertos para un rendimiento de reacción óptimo. Después de la incubación, agregue PNGase F e incube durante otros 20 minutos a 60 grados Celsius para separar los glicanos de los anticuerpos purificados.
Después de la liberación de N-glicanos, cierre el tubo de muestra y el vórtice. Luego, agregue acetonitrilo al tubo de muestra, vórtice e incube a temperatura ambiente durante un minuto. Coloque los tubos de muestra en el soporte magnético para separar las perlas de la solución.
Luego, usando una pipeta, retire cuidadosamente el sobrenadante sin tocar las cuentas. Agregue la solución de etiquetado de glicanos que contiene fluoróforo a la muestra en una campana extractora de humos y mezcle mediante vórtice. Después de una incubación de 20 minutos a 60 grados centígrados con tapas abiertas, retire el exceso de tinte lavando la muestra tres veces en acetonitrilo.
Luego, eluya los glicanos etiquetados en agua de doble destilación. Coloque el tubo de muestra en el soporte magnético y recoja el sobrenadante enriquecido con glicanos purificados y etiquetados. A continuación, prepare y cargue todos los estándares y muestras requeridos en las posiciones de bandeja designadas.
Ejecute el protocolo de análisis de glicanos y analice e identifique los glicanos presentes en la muestra utilizando el software adecuado. El análisis de Western blot mostró una reducción de la expresión de la proteína Fut8 en células transfectadas con una mezcla de tres construcciones de DsiRNA Fut8. Las estructuras de glicanos de las células de derribo también mostraron una disminución de la fucosilación.
Esta tendencia fue más pronunciada en estructuras agalactosiladas y observada en menor medida en estructuras galactosiladas. Se observó una reducción de dos veces en la fucosilación del núcleo a partir de la electroporación utilizando dos pulsos de onda cuadrada en comparación con un solo pulso de onda cuadrada sin diferencias significativas en la viabilidad celular. En general, el aumento de la concentración de ARN de interferencia corta tiene una gran interferencia en la fucosilación del núcleo que el aumento del tiempo de cosecha.
La relación entre el agua y el acetonitrilo determina si los glicanos están en solución o son parte de las perlas. Eso es crucial recordar durante los pasos de lavado para evitar la eliminación accidental de los glicanos etiquetados de la solución. Un experimento de seguimiento podría implicar la caracterización de anticuerpos monoclonales purificados utilizando ensayos basados en células para cuantificar la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos y la citotoxicidad dependiente del complemento.
