La capacidad de adquirir grandes cantidades de datos de experimentos de imágenes de calcio ha mejorado drásticamente, especialmente con experimentos de imágenes de tejidos. Nuestros protocolos describen técnicas de análisis adecuadas para cuantificar y describir estos conjuntos de datos. Nuestros protocolos generan una gama de valores espaciales, temporales e intensidad que son intrínsecos a la señalización de calcio en tejidos enteros y esto se puede perder en análisis más rudimentarios.
Una hora antes de la transferencia de imágenes un intestino delgado cosechado de un ratón con células intersticiales de Cajal o ICC que expresan específicamente un indicador de calcio genéticamente codificado a la etapa de un microscopio confocal de disco giratorio. Y perfunda continuamente el tejido con 37 grados Celsius Krebs-Ringer bicarbonato o solución KRB. Usando un aumento de 60 a 100 X localice el plexo mientérico ICC o ICC-MY en forma estelar entre las capas musculares lisas circulares y longitudinales del intestino delgado.
A continuación, localice el plexo muscular profundo en forma de husillo ICC o ICC-DMP en un solo plano entre la capa muscular lisa circular y el plexo submucoso y guarde las películas como una pila de imágenes TIFF. Para crear mapas espaciotemporales o SRM de la actividad de calcio ICC-DMP, abra la pila de imágenes en ImageJ y haga clic en Imagen, Tipo y 32 bits para modificar la calidad de la imagen. Para crear un escaneo de línea, haga clic con el botón derecho en la herramienta de selección de líneas y seleccione línea segmentada.
Mediante los clics izquierdos individuales, dibuje una línea a lo largo del acceso medio de un ICC-DMP individual, haciendo doble clic cuando se haya esbozado toda la celda. Seleccione Imagen, Pilas y Reslice. Aparecerá una ventana emergente.
Seleccione Girar 90 grados para orientar el escaneo de línea de izquierda a derecha para que se pueda calibrar y leer contra el tiempo en el eje X con espacio en el eje Y y haga clic en Aceptar. Aparecerá el mapa espaciotemporal. Para medir con precisión la amplitud de las señales de calcio del mapa, seleccione la selección rectangular y dibuje una región de interés alrededor del área dentro de la STM que muestre el área de fluorescencia más uniforme y menos intensa. Haga clic en Analizar e histograma para obtener un valor medio de la intensidad dentro de la región de interés seleccionada y haga clic en Editar, Selección, Seleccionar todo para seleccionar todo el STM.
A continuación, haga clic en Procesar, Matemáticas y dividir e introduzca el valor medio de la intensidad con la región STM seleccionada de interés en el cuadro emergente. El STM se volverá negro. Corrija esto haciendo clic en Imagen, Ajustar, Brillo/Contraste y Automático en la ventana emergente.
El escaneo de línea ahora se calibrará para la amplitud con la intensidad de la fluorescencia expresada como la fluorescencia dividida por la fluorescencia cero. El STM mostrará el número de fotogramas en la pila TIFF en el eje X y el número de píxeles que representan la longitud de la celda en el eje Y. Para cuantificar los datos temporales y espaciales de las señales de calcio, haga clic en Imagen y Propiedades e introduzca los valores adecuados para calibrar completamente la STM para el espacio y el tiempo en la ventana emergente.
Para analizar los eventos de calcio individuales, haga clic en Línea recta y haga clic y arrastre en la STM para dibujar una línea horizontal recta a través del centro de un evento de calcio paralelo al eje X. A continuación, haga clic en Analizar y trazar perfil. Aparecerá un cuadro que muestra el perfil de la gráfica del evento de calcio.
Para el análisis basado en partículas de los datos de señalización de calcio ICC-MY, abra el archivo de película en Volumetry y haga clic con el botón derecho para seleccionar Filtro STK, Diferenciar. Haga clic con el botón derecho del 200o para introducir un valor que diferencie. Pulse Intro y haga clic con el botón izquierdo para iniciar la diferenciación.
Para crear partículas, utilice el botón central del ratón para desplazarse por la película para seleccionar una sección de fotogramas de 20 a 40 que incluya un período de reposo, seguido de la aparición de un clúster transitorio de calcio y de 20 a 40 fotogramas que siguen justo después del clúster. Cuando todos los fotogramas se hayan seleccionado, haga clic con el botón derecho en la ventana de la película para acceder a la información de partículas de STK OPS Ramp DS y haga clic para ejecutar una rutina de análisis de partículas que aumente progresivamente el umbral de la intensidad máxima a la mínima. Para garantizar un análisis de partículas exitoso, asegúrese de incorporar tanto no actividad del clúster transitorio precálico y de tanta falta de actividad del clúster transitorio posterior al calcio.
Esto ayudará a aumentar la relación señal-ruido. El análisis se mostrará gráficamente en la ventana de trazado como trazado de ruido y en la ventana de trazas como tres trazos de color con el trazo verde que representa el número de partículas, el trazo rojo que representa el tamaño medio de partícula y el trazo azul que representa el umbral de intensidad absoluta. Para equilibrar el histograma, la gráfica de ruido de partículas pulse H en el teclado.
A continuación, presione la tecla de corchete derecha para recorrer los esquemas de color hasta que el fondo sea blanco con los trazos de color en la parte superior. Pulse F en el teclado una vez para abrir una herramienta de medición. A continuación, presione F una segunda vez para marcar una sola línea vertical en la barra de desplazamiento de la ventana de trazas en el trazado en la intersección donde los trazados de color comienzan a cambiar al lado derecho.
Dentro de la ventana de seguimientos utilice el botón central del ratón para desplazarse desde el punto de inflexión del trazo rojo a la línea vertical blanca marcada. Después de tomar nota del promedio Y mostrado, haga clic de nuevo en el botón central del ratón dentro de la ventana de seguimientos para anular la selección del trazo azul. En la ventana de la película, haga clic en C para abrir una rueda de color y D para ajustar el umbral.
Las partículas válidas ahora se mostrarán en rojo, y las que se saturarán serán blancas. Utilice el botón izquierdo del ratón para desplazarse hasta que se eliminen las áreas blancas y utilice el botón central del ratón para ajustar el valor numérico amarillo de la rueda de color al valor medio Y para asignar todo en rojo como una partícula transitoria de calcio activa en el punto de umbral determinado. Para guardar los datos como un archivo de partículas basado en coordenadas, haga clic con el botón derecho del 200 en STK 3D, guarde el cero de partícula y haga clic con el botón izquierdo del 200 al índole para guardar el archivo.
Para crear mapas de calor de actividad de partículas, abra el archivo de partículas guardado y haga clic con el botón derecho en la ventana de película para acceder a las partículas STKops, StatMap Flag e introduzca las asignaciones de marca que desea analizar. Haga clic para aplicar el análisis y un mapa de calor que muestre el total de partículas para toda la longitud de grabación con diferentes colores que representan el porcentaje de ocurrencia a lo largo de la grabación. Haga clic con el botón derecho del 200o para guardar el mapa de calor como un archivo TIFF.
A continuación, haga clic con el botón derecho en la ventana de la película para acceder a la medida de partículas, las estadísticas de partículas STK son iguales e introduzca una asignación de marca para el análisis. Se generará una serie de seguimientos en la ventana de seguimiento. El análisis STM proporciona la capacidad de monitorear y registrar las características espaciales de la señalización de calcio, como la propagación espacial y la velocidad de propagación.
Esta información se puede acumular para proporcionar una visión bastante completa de los comportamientos de señalización de calcio dentro de las células en sus entornos nativos. Mediante el análisis de partículas, la información cuantitativa sobre la señalización de calcio se puede calcular midiendo el área de partículas y el recuento de partículas, que en conjunto se pueden utilizar para determinar los rangos espaciales de activación de la señal de calcio dentro de un campo de visión especificado. El análisis de partículas también permite la cuantificación en profundidad de la señalización subcelular de calcio mediante el examen de la ubicación y las probabilidades de disparo de los sitios de cocción de calcio.
Al asignar las partículas en diferentes banderas basadas en sus características temporales, las partículas que inician se pueden mapear con precisión. Y una gran cantidad de datos duros adquiridos en el número de sitios de iniciación, el tamaño del sitio en píxeles y micrómetros, la probabilidad de que cada sitio de iniciación se dispare una o varias veces durante cada grupo transitorio de calcio, y el porcentaje de sitios de disparo que se disparan durante cada ciclo de racimo transitorio de calcio se pueden obtener. La coherencia es la clave del éxito en este protocolo.
Todos los conjuntos de datos y todas las películas deben tratarse exactamente igual para garantizar resultados fiables y repetibles. Esto es especialmente cierto cuando se trata de archivos de partículas. Nuestros protocolos permiten una caracterización profunda de la señalización de calcio in situ, y una serie de métodos estadísticos, cuando se utilizan adecuadamente, pueden evaluar las diferencias entre una gama de parámetros espaciales y temporales.
Estas técnicas de análisis en nuestro protocolo han permitido a los investigadores hacer y responder preguntas previamente no abordables relacionadas con el ritmo intestinal, y la inervación intestinal, así como el control neuronal del tracto urinario inferior.
