Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 2R01 GM53132 y GM071558 P50.

1. Las células de carga con los indicadores de calcio <ol><li> Células de la placa de 35 mm con fondo de cristal platos MatTek (o cualquier otro fondo de cristal, ver cámaras). </li><li> Si se usa capa miocitos primarios de las cámaras un día antes con 10μg/ml laminina. Placa cardiaca miocitos (aislado de los perros adultos, ratas recién nacidas, u otro organismo), en KB buffer (K-inversión de tampón de Tyrode 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de KHCO3, 2 mmol / L de MgCl 2 y 0,4 mmol / L de KH 2 PO 4, pH 7,5) y el cambio poco a poco a la M199 suplementado con suero fetal bovino 15% y el 1% y el 0,5% streptamycin gentamicina y se incuba a 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Se incuban las células con el calcio verde mañana (01.05 M, Molecular Probes) o cualquier otro indicador de calcio deseada durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Cubra el plato con papel de aluminio para evitar photobleaching de la tintura. </li><li> Se lavan las células tres veces con Leibovitz15 medio con EGTA 14 mm (si la realización de experimentos en los niveles bajos de calcio) o cualquier otro medio de visualización adecuado. </li><li> Incubar durante 30-45 minutos en otro medio Leibovitz15 containing14mM EGTA. </li><li> Si las pruebas de los efectos de los inhibidores (es decir, 10μM U73122 PLC inhibidor) que añadir durante la segunda incubación. </li></ol> 2. Microinyección de células <ol><li> Cardiomiocitos cultura en el fondo de cristal platos MatTek (o cámaras de visión) durante 24 horas. </li><li> Cambiar el medio de fenol libre de Leibovitz-15 con 14 mM de EGTA (cardiomiocitos tienen que ser inyectados en el medio libre de calcio, otras células pueden ser inyectados en el calcio que contienen medio). </li><li> Prepare una solución de microinyección - nuestros estudios utilizaron un péptido que elimina Gα q - interacciones caveolae. Tenga en cuenta que sólo una pequeña cantidad de volumen que se inyecta en la célula (~ fL) y por lo tanto las poblaciones razonablemente concentrada debe ser utilizado. Utilizamos 2 M de este péptido, CAV3-andamio, con DAPI en un medio libre de calcio. DAPI es un blue colorante que tiñe el núcleo y permite la identificación de las células que han sido microinyección. DAPI no interfiere con la fluorescencia de los indicadores de calcio muchos. La cantidad de DAPI es variable y se utilizan generalmente suficiente para visualizar el núcleo (0,5 y 2 M) </li><li> Prepare una solución de control con DAPI - el trazador de tinta solo. </li><li> Para microinyecciones utilizar agujas auto-tira o disponibles en el mercado. La práctica con la inyección de medio de contraste para determinar los parámetros adecuados de la aguja. Tomamos nota de que las diferentes células podrían requerir diferentes diámetros y presiones de la aguja de microinyección. </li><li> Utilizar el sistema de microinyección automatizado, por ejemplo, un NI2 InjectMan con una bomba de FemtoJet de Eppendorf. Ajuste la presión de inyección P i a 90 hPa, y la compensación de la presión P C a 45 hPa. Establecer el t tiempo de inyección a 0,7 s. Reajustar los parámetros de la inyección que necesita. </li><li> Realizan microinyecciones en un microscopio invertido (por ejemplo, Zeiss AxioveRT 200M), equipado con el objetivo a largo distancia de trabajo de contraste de fase (por ejemplo, la fase de aire 40 veces el objetivo 2). </li><li> Inyectar mayor cantidad de células posible de una manera rápida. Examinar las células inyectadas mediante el contraste de fases para seleccionar las células viables. </li></ol> 3. Co-inmunofluorescencia estudios <ol><li> Lavar las células dos veces con PBS y fijar con el 3,7% de paraformaldehído durante 30 minutos. Si es necesario, las células pueden ser estimuladas antes de la fijación. </li><li> Lavar las células fija tres veces con PBS y se incuban con NP40 0,2% en PBS durante 5 minutos. </li><li> Bloquear con PBS que contenía 4% de suero de cabra (o suero adecuado) durante 1 hora. </li><li> Se incuban las células con el anticuerpo primario con una dilución adecuada con suero de cabra al 1% en PBS durante 1 hora. </li><li> Lavar las células tres veces durante 10 minutos con 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 seguido por la adición de marcado con fluorescencia secundaria de anticuerpos, tales como Alexa-Fluor-488 anti-conejo o Alexa-Fluor 647-anti-ratón anticuerpo secundario diluido a 1: 1000 1% de suero de cabra en PBS (tenga en cuenta que al probar dos proteínas diferentes los anticuerpos primarios debe plantearse en las diferentes especies y la secundaria tiene que estar en contra de las especies correspondientes). </li><li> Se incuba a 37 ° C durante una hora, lavar tres veces con TBS. </li><li> Ver las células en tampón TBS u otro medio de visualización adecuado. </li></ol> 4. Imágenes de calcio rápida <ol><li> El uso de láser microscopio confocal de barrido (por ejemplo Fluoview 1000 Olympus). </li><li> Uso objetivo de alta apertura numérica. </li><li> Establecer los parámetros de adquisición. Para la excitación de calcio nm verdes utilizan 488 y 515 de largo pasan filtros de emisión. </li><li> Ajustar el tiempo de pixel - para la medición de calcio rápidamente se establece en 2 ms / pixel. </li><li> Ajuste el zoom de la imagen para alcanzar un tamaño de píxel de 0,05 a 0,3 micras. </li><li> Seleccione una línea de una célula de la elección en una región particular. </li><li> En la ventana del controlador de selección de tiempo de adquisición en tiempo de por lo menos 1500 ciclos (cuando se requieran plazo dela respuesta - 1,3 ms / línea daría 2 segundos). </li><li> Registro de antecedentes de lectura antes de la estimulación. </li><li> Estimular las células con 5 carbacol M e iniciar inmediatamente el registro de datos. Mantener las células en 1 ml de medio Leibovitz15, preparar 10 carbacol M en Leibovitz15 y añadir con cuidado 1 ml en el plato </li></ol> 5. Análisis de datos <ol><li> Extracto de la intensidad de cada píxel de la imagen grabada. Guardar los datos de intensidad como una tabla utilizando Fluoview 1000 software. </li><li> Importación de datos de intensidad en Sigmaplot o un programa de análisis de datos similares y la bandeja de los datos en ~ 90-40 contenedores. Compare con el control de los experimentos y el ruido electrónico. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Hemos fotografiado en las células láser confocal de barrido microscopio LSM510 (Zeiss, Jena, Alemania) equipado con una excitación láser de múltiples líneas y un 40x/1.2 apocromático NA objetivo de inmersión en agua. En la figura. 1 (roja) se muestra el distribution de caveolae en caninos ventricular cardiomiocitos adultos que han sido fijadas y teñidas con un anticuerpo para la caveolina-3, que es la principal proteína estructural caveolar en estos 9 celdas. Caveolina-3 se immunolabelled con Alexa-647 y entusiasmados con la línea de 633-nm de uno Él: Ne laser. Las imágenes fueron registradas con filtro LP650 nm de emisión. La distribución de la caveolina-3 se comparó con Gα q que se immunolabeled con Alexa-488 (verde). Alexa-488 se entusiasma con 488nm de iones de argón láser de línea y se grabó la imagen usando el filtro de emisión BP505-530nm. En estas mediciones colocalización, los dos fluoróforos se entusiasmaron de una manera secuencial con la adquisición de varias pistas. Este procedimiento minimiza el canal de cross-talk. Análisis de los datos de colocalización se realizó utilizando el software de AIM siempre con óptica Carl Zeiss LSM510-Meta. Como puede verse, las dos proteínas están colocalized. Para determinar cómo el acoplamiento entre la caveolina-3 y Gα <sub&gt; q afecta a las señales de calcio, se llevó a cabo los estudios de imágenes de calcio en un sistema de microscopía confocal de barrido láser (Fluoview, Olympus, Tokio, Japón) acoplado a un microscopio invertido (IX70, Olympus) con un objetivo de 40x (UPlanApo, Olympus, apertura numérica 1,3), aunque estas medidas también se puede realizar en los sistemas de Zeis descrito anteriormente. En estas mediciones, las células se cargaron con Ca 2 + Verde. Estamos entusiasmados con el tinte 488 nm láser de iones de argón y recogieron las imágenes a través de un filtro de emisión LP515. Cuadros de imagen han sido recogidos en intervalos de 500 ms. Valores de intensidad para cada píxel se obtuvieron mediante el software Olympus y ImageJ. El modo de escaneo en línea fue utilizada para el análisis cuantitativo de más rápido Ca 2 + transitorios y Ca 2 + chispas. El tamaño de los píxeles utilizados en el presente estudio fue 0.1-0.3 micras. La velocidad de la línea de barrido fue de varios cientos de ms por línea. En la figura. 2 se muestra un análisis de la línea de Ca 2 + Green-cargado de cardiomiocitos en el píxel dtiempo y fue de 2 ms, el tiempo de la línea fue de 142 ms. La imagen se compone de 1.200 líneas. Cada línea de la exploración corresponde a la fluctuación de la intensidad de la Ca 2 + Verde consta de 71 puntos tomados en un rango de 142 ms, y puede ser utilizado como una rápida lectura de las respuestas de calcio. Por ejemplo, en la figura. 3 se muestra la actividad de Ca 2 + de una sola línea de un cardiomiocito individual, según lo medido por Ca 2 + intensidad de la fluorescencia verde en función del tiempo en segundos antes (arriba) y después (abajo) la adición de carbacol M 5, que mejora la el nivel de Ca 2 + intracelular a través de Gα q-PLCβ actividad. Cuando varias líneas son un promedio, la estimulación carbacol produce un aumento de ~ 1,8 veces en Ca 2 + intensidad de verde. Debido a las variaciones en las condiciones experimentales (temperatura ambiente, la potencia del láser, la respuesta del detector, la distribución de tinta, etc), este aumento no puede ser visto en personalíneas de barrido. A pesar de que los valores de intensidad (valores y ejes) son similares, es claro que la trama estimulada por carbacol en la parte inferior tiene picos mucho más amplio, que corresponde a los niveles de calcio más sostenido, que los picos de fluctuación estrecha visto antes de la estimulación. Este aumento relativo en la ampliación y la intensidad oculta oscilaciones pequeñas, más lento. Nuestro objetivo es discriminar mejor entre estos diferentes tipos aparente de las fluctuaciones de calcio. Otro ejemplo de estas fluctuaciones rápidas de calcio se muestra en la fig. 4. El gráfico superior muestra los datos en bruto de la línea de cardiomiocitos ventriculares estimulados (rojo) y un promedio de 3 rastros línea se muestra en negro. Para determinar la medida en que estas fluctuaciones de calcio fueron mediadas por Gα q - caveoline3 interacciones, microinyección de un péptido que desestabiliza la caveolina-3 - Gα interacciones q (es decir, CAV3 péptido) que elimina el tiempo de Ca 2 + actual, y estos datos se muestran en azul(Que tenga en cuenta que restan 500 de la CAV3 intensidades péptido para que las dos trazas se pueden discernir mejor). Nos importan las columnas de datos en bruto de nuestros archivos de Excel en Sigmaplot (Jandel, Inc.) y lleva a cabo un análisis de histogramas. En este análisis, el número de eventos se agrupan en un número igual de cajas (cajas) para producir un histograma. La anchura de bin representa un intervalo de tiempo igual. Las intensidades se insertan en el tiempo diferentes se une de manera que la altura de una caja en particular representa el número de veces que la intensidad se produce en la ventana de tiempo en particular. Dado que este tipo de análisis sólo depende de la recolección de datos a la velocidad de barrido mismo, muchas huellas se pueden analizar de forma simultánea. Además, este análisis no es sensible a las diferencias en los niveles de tinta, láser de potencia, etc, y el ruido electrónico y de fondo se produce a escalas de tiempo muy rápido y sólo se ven en los primeros 1-2 cubos. El histogra correspondientems de los datos en bruto en la figura. 4 se muestran en la parte inferior de la página. El histograma para el control de las células se distribuyen en un gran número de contenedores que corresponde a una distribución de tiempo amplio, como se muestra por la línea roja (la línea es para guiar a los ojos y no se asume el modelo). Por el contrario, los contenedores para la respuesta de las células donde se interrumpió el Gα q-CAV3 interacción péptido se limitan a una distribución bin estrecho que sugiere que la presencia del péptido elimina ya los flujos de duración. La microinyección de un péptido de control que no interrumpa Gα q-CAV3 produce un histograma similar a la ONU con inyección de células 8. En la figura. 5 se compara la intensidad de las fluctuaciones rápidas de Ca 2 + Verde en adultos cardiomiocitos ventriculares caninas (izquierda) y fresco, sin estimular cardiomiocitos de rata neonatal que carecen de caveolas (derecha). Aquí, los histogramas de las intensidades correspondientes durante un período de tres minutos fueron agrupadas<html> a 35 para ver los eventos más lento de calcio. Tenga en cuenta que los cardiomiocitos neonatales mostrar las fluctuaciones de velocidad en una línea de base plana que muestra la falta de Ca 2 + más lenta la actividad, mientras que una línea de base más estructurada es visto por las células adultas. Estas diferencias son más fáciles de ver en los histogramas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" /> Imágenes Figura 1. Canina de cardiomiocitos adultos ventricular muestra la distribución de Gα q immunolabeled con Alexa-488 en Alexa-488 se entusiasma con 488nm de iones de argón láser de línea y la imagen se ha grabado con filtro de emisión BP505-530nm. La parte superior derecha es la misma imagen de visualización de la localización de la caveolina-3 immunolabeled con Alexa-647, entusiasmados con la línea de 633-nm de uno Él:. Ne láser y grabado con LP650 nm de emisión filtro La imagen combinada en colocalización se ve de color naranja se encuentra en la parte inferior izquierda con una imagen ampliada a la derecha. <html> &quot;Pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen de calcio de la vida canina cardiomiocitos ventriculares adultos cargados de Ca 2 + Verde. La imagen fue tomada en un sistema de microscopía confocal de barrido láser con un objetivo de 40x usando un láser de 488nm de iones de argón y un filtro de emisión LP515. La imagen se compone de 1.200 líneas, el píxel tiempo de permanencia fue de 2 ms, y el tamaño del pixel fue de 0,1 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" /> Figura 3. Fluctuaciones TOP intensidad de un seguimiento de la línea de la vida canina cardiomiocitos ventriculares adultos cargados de Ca 2 + verde y la imagen como se describe, y BOTTOM la misma célula estimulada por la adición de 5 M carbacol. <html> / 3505fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. TOP Un ejemplo de trazas la línea de la vida canina cardiomiocitos ventriculares adultos cargados de Ca 2 + verde (rojo) tomados de más de 180 ms, donde se muestra el promedio de 3 se hace referencia como una línea de negro, y en comparación con una célula que se microinyectó con un péptido que altera Gα q-caveolina 3 asociación (rojo) en un promedio de tres trazos en negro. Tomamos nota de que restamos 400 cuenta la intensidad del conjunto menor de datos para fines de visualización. Los paneles inferiores son los histogramas de los datos correspondientes desechado como se describe en el texto, y donde el número bin es arbitraria y el número de bin (o, simplemente, contar) se corresponde con la cantidad total de la intensidad en que Bin particular. Tomamos nota de que las líneas de la línea roja y azul dibujada en el control (izquierda) y los histogramas de péptidos (derecha) para permitir la fácil identificación y comparación de los datos y no hay un modelo que se supone. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Fluctuaciones de intensidad de Ca 2 + Verde en adultos cardiomiocitos ventriculares caninas (izquierda) y fresco, sin estimular cardiomiocitos de rata neonatal que carecen de caveolas (derecha) y sus correspondientes histogramas se muestran a continuación.

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No hay conflictos de interés declarado.

Hemos desarrollado un método para ver y aislar las señales rápidas de calcio en los cardiomiocitos de vida. Si bien las condiciones experimentales de estas mediciones han sido previamente aplicada a otros sistemas celulares 10, así como los cardiomiocitos 11, el uso de histogramas y análisis bin permite que los datos de muchos de Ca 2 + eventos a ser adquiridos. Más rápido los acontecimientos pueden ser fácilmente aislados de los más lentos y modelos adaptados a comprender sus m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Cardiomiocitos tienen múltiples flujos de Ca 2 + de duración variable que trabajan en conjunto para optimizar la función de 1,2. Los cambios en Ca 2 + actividad en respuesta a los agentes extracelular generalmente regulado por la fosfolipasa Cβ-Gα vía q localizada en la membrana plasmática que es estimulada por agentes tales como la acetilcolina 3,4. Recientemente, hemos encontrado que el plasma dominios de la proteína de membrana llamada caveolas 5,6 activado puede atrapar Gα q 7. Esta trampa tiene el efecto de la estabilización del estado de activación de q Gα y prolongado resulta en Ca 2 + en cardiomiocitos señales y otros tipos de células 8. Hemos descubierto el sorprendente resultado de la medición de las respuestas dinámicas de calcio en una escala rápida en los cardiomiocitos de vida. Brevemente, las células se cargan con un fluorescente de Ca 2 + indicador. En nuestros estudios, hemos utilizado Ca 2 + Verde (Invitrogen, enc.) que exhibe un aumento en la intensidad de emisión de fluorescencia tras la unión de los iones de calcio. La intensidad de la fluorescencia se registra para utilizar un modo de línea de exploración de un microscopio confocal de barrido láser. Este método permite la adquisición rápida de la evolución temporal de la intensidad de la fluorescencia en píxeles a lo largo de una línea seleccionada, la producción de varios cientos de huellas de tiempo en la escala de tiempo de microsegundos. Estas huellas muy rápido se transfieren a Excel y luego en Sigmaplot para el análisis, y se comparan con las huellas obtenidas por el ruido electrónico, colorante libre, y otros controles. Para analizar las respuestas de Ca 2 + de diferentes tasas de flujo, se realizó un análisis histograma que binned intensidades de los píxeles con el tiempo. Hurgar en la basura que nos permite agrupar a más de 500 huellas de los análisis y visualización de los resultados compilados espacial y temporalmente en una única parcela. Por lo tanto, la lentitud en Ca 2 + olas que son difíciles de discernir cuando los análisis se superponen debido a la colocación de diferentes picos y ruido, puede ser visto fácilmente enlos histogramas agrupada. Flujos muy rápidos en la escala de tiempo de la medición muestran una estrecha distribución de intensidades en los contenedores de muy poco tiempo, mientras que más de Ca 2 + ondas de mostrar los datos agrupada con una amplia distribución en contenedores de tiempo más largo. Estas distribuciones horarias diferentes nos permiten analizar el tiempo de los flujos de Ca 2 + en las células, y para determinar su impacto en diversos procesos celulares.

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Se presenta un método para aislar rápida (microsegundos) eventos de calcio de los flujos más lentos en las células vivas mediante microscopía confocal de barrido láser. El método mide las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia de los indicadores de calcio por los escáneres de la línea de la grabación de varios cientos de píxeles en una celda. Análisis del histograma nos permite aislar las escalas de tiempo de los flujos de calcio diferentes.

La medición de flujos rápidos de calcio en los cardiomiocitos

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.1K vistas.  Queensborough Community College. Se presenta un método para aislar rápida (microsegundos) eventos de calcio de los flujos más lentos en las células vivas mediante microscopía confocal de barrido láser. El método mide las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia de los indicadores de calcio por los escáneres de la línea de la grabación de varios cientos de píxeles en una celda. Análisis del histograma nos permite aislar las escalas de tiempo de los flujos de calcio diferentes.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Cerca de la medición de la membrana plasmática y Global Dynamics calcio intracelular en los astrocitos

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Investigación

Biología

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.