Name: imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

Presentamos los procedimientos detallados para obtener imágenes locales de Ca2 + eventos en neuroblastoma humano SH-SY5Y células. Estos procedimientos pueden ser adaptados a la imagen intracelular de Ca 2 + señales en muchos tipos de células 8-10. 1. Preparación de las células <ol><li> Cultura de las células para obtener imágenes de acuerdo a las instrucciones que aparecen en la página web de su proveedor. </li><li> Unos pocos días antes de la imagen, las células de cosecha cultivadas en un matraz de cultivo de tejido usando 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (2-3 min). Después de la separación, añadir un volumen igual de medio de cultivo para inactivar la tripsina. </li><li> Realizar un recuento de células usando un hemocitómetro y semillas células en placas de formación de imágenes de fondo de vidrio a una densidad de 3-7 x 10 4 células por placa. Seleccione las celdas para los experimentos de imagen cuando llegan a 60% de confluencia (2-3 días). </li></ol> 2. Preparación de soluciones y reactivos <ol><li> Preparar una Ca 2 + que contienen HEPES buffersolución de sal (Ca 2+ -HBSS) compuesto de (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, MgCl2 1, HEPES 10, y 10 de la glucosa; pH = 7,4 a temperatura ambiente (RT) con NaOH. Preparar Ca 2+ -HBSS sin la adición de glucosa y se almacena a 4 ° C; añadir glucosa a la solución inmediatamente antes de su uso. </li><li> Solubilizar formas de membrana permeable de la Ca 2+ indicador fluorescente Cal-520 (1 mM), ci-IP 3 (200 mM), y EGTA (100 mM) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) que contiene 20% de Pluronic F-127. Alícuota de estos reactivos en tubos y tienda de Eppendorf, protegidos de la humedad y de la luz, a -20 ° C. </li></ol> 3. Carga de células con membrana permeable-Cal-520, ci-IP 3 y EGTA <ol><li> Preparar el &quot;tampón de carga&quot; mediante la dilución de las soluciones madre de la membrana permeable Cal-520 y ci-IP 3 a una concentración final de 5 mM y 1 mM, respectivamente, en Ca 2+ -HBSS. </li><li> Aspirar cumedios lture y enjuagar las células mediante la sustitución de los medios de comunicación con Ca 2+ -HBSS tres veces. </li><li> Eliminar Ca 2+ -HBSS e incubar las células en tampón de carga durante 60 minutos a RT en la oscuridad. </li><li> Retire tampón de carga y enjuague células mediante la sustitución de los medios de comunicación con Ca 2+ -HBSS tres veces. <ol><li> Si lo desea, en este paso, células de carga con EGTA / AM por dilución de la solución madre a una concentración final de 5 mM de Ca 2+ -HBSS y luego se incuban las células durante 30-60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de esta incubación, lavar las células tres veces con Ca 2+ -HBSS antes de proceder al paso 3.5. </li></ol></li><li> Se incuban las células en Ca 2+ -HBSS durante 30 min para permitir la de-esterificación de los reactivos cargados. </li><li> Inmediatamente antes de la proyección de imagen, reemplace Ca 2+ -HBSS con &quot;fresco&quot; Ca 2+ -HBSS con el fin de eliminar cualquier tinte que podrían haber filtrado al baño durante la incubación final. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Adquisición de imágenes <ol><li> Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión sobre el objetivo 100X APO TIRF (NA 1.49). </li><li> Montar el plato de imagen en el escenario del microscopio invertido y traer las células en el foco con luz transmitida. Es importante asegurar el plato de formación de imágenes para evitar el movimiento durante la grabación. </li><li> Iluminar células con un láser de 488 nm para excitar Cal-520 y recoger la fluorescencia emitida (λ&gt; 510 nm) utilizando una cámara EMCCD de alta velocidad. NOTA: El paquete de software que opera el microscopio permite al usuario para traducir una lente de enfoque permitiendo que el rayo láser para ser introducido ya sea en el borde extremo de la abertura de vuelta objetivo (para la excitación TIRF) o más en el centro (para la excitación &quot;WF&quot;). </li><li> Usando el software EMCCD, reducir el campo de la imagen de los plenos 512 x 512 píxeles con el fin de recoger datos en la resolución temporal necesaria para capturar Ca 2+ eventos locales. NOTA: Por ejemplo, quad centroadquisición de 256 x 256 píxeles acelera la velocidad de adquisición a 66 fps. También es posible aumentar aún más la velocidad de fotogramas de la cámara EMCCD a 500 fps usando una función de modo de recorte aislado. </li><li> Configurar el software para grabar automáticamente unos pocos segundos de actividad basal, entregar un destello UV a las células y continuar la grabación por otro 10-30 seg. NOTA: Un destello UV se suministra usando una fuente de luz de arco de xenón introducido a través de un espejo dicroico que refleja UV en el puerto trasero del microscopio. La duración y la intensidad del flash UV se ajusta empíricamente para evocar una frecuencia deseada de Ca 2+ eventos locales. </li><li> Guardar archivos de imagen como las pilas para el análisis fuera de línea. </li></ol> 5. Análisis Automatizado Ca 2+ Imagen NOTA: Es posible visualizar, procesar y analizar datos obtenidos con muchos paquetes de software comerciales. Sin embargo, hemos desarrollado un algoritmo para automatizar rápidamente una identificaciónanálisis d de Ca 2 + señales locales. Una descripción detallada de los filtros espaciales y temporales utilizados en este algoritmo, la generación de las Delta F / F 0 y la identificación / análisis rutinas se puede encontrar en 11. Este algoritmo ha sido desarrollado para funcionar en la plataforma de software de código abierto Python, y puede obtenerse, junto con muestras de datos experimentales y las instrucciones detalladas de usuario, enviando un correo electrónico del autor correspondiente (ismith@uci.edu). <ol><li> Convertir archivos a ser importados en el algoritmo de encargo por escrito al formato de archivo de la multi-plano .tiff. </li><li> Busque la carpeta que contiene el algoritmo de análisis y haga doble clic en el run.exe. </li><li> Seleccione el archivo .tiff para ser analizada. </li><li> Elija los parámetros de análisis en el cuadro de diálogo abierto. Ver Figura 2A para los parámetros por defecto de los datos de la muestra. </li><li> Determinar el nivel de negro para ser desplazada con respecto a la pila de imagen, ya sea moviendo el cursor a una parte del campo de vista que hace not contiene una celda (ver Figura 2B) o introduciendo manualmente un nivel de negro mediante el símbolo del &quot;Nivel Negro Set &#39;. </li><li> Observar cuatro ventanas en la pantalla siguiente análisis por el software (Figura 2C-F). C es una imagen monocroma de reposo de fluorescencia de las células que se analiza. Casillas blancas superpuestas en esta imagen son los lugares de actividades, determinadas como las posiciones de los centroides de funciones gaussianas bidimensionales instalados en eventos. </li><li> Haga clic en cada lugar del evento o presione las teclas de cursor para desplazarse entre los eventos. Al hacerlo, el fondo-resta, Gauss alisó cambios de relación de fluorescencia (? F / F 0) en cada uno de estos sitios de actualización en la ventana D. NOTA: Rojo destacó eventos están decididos a proceder de ese sitio en particular y no de &quot;sangrar a través &#39;de la actividad localizado en lugares adyacentes. El trazo azul inferior indica que la señal de fluorescencia en el sitio seleccionado superó la detecciónumbral, mientras que la línea negro identifica los eventos procedentes de ese sitio en particular (que corresponde al rojo eventos resaltado). </li><li> Haga clic en un rojo resaltado evento para actualizar la ventana E que muestra la evolución temporal del evento, y la ventana F, que muestra el perfil espacial del evento promedio durante su curso temporal, junto con el perfil espacial de la función de Gauss equipada. </li><li> Revisar manualmente los eventos que se han identificado para que los artefactos pueden ser rechazadas desde el análisis. Eliminar este tipo de eventos haciendo clic derecho en el rojo eventos resaltado. NOTA: En nuestras manos, Ca 2+ flujo a través de los canales individuales IP 3 R evoca señales con Df / F 0 alrededor de 0,11, por lo que es probable que sean falsos positivos ningún &#39;eventos&#39; detectados apreciablemente más pequeños que esto. </li><li> Exportar datos seleccionando &quot;Guardar en Excel&quot; o exportar datos en una base por célula dibujando alrededor de la célula de interés y seleccionar &#39;Guardar CellR17 ;. Nota: Los datos se guardan en la misma carpeta que la pila imagen original. </li></ol>

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	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. 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S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Describimos aquí los protocolos locales para obtener imágenes de Ca 2+ eventos en células de mamífero en cultivo usando Ca 2+ indicadores fluorescentes. Además, se describe un algoritmo con una interfaz de usuario intuitiva que automatiza la identificación y análisis de los datos adquiridos. El procedimiento descrito aquí utilizan el Ca 2+ fluorescente indicador Cal-520, pero muchas otras Ca 2+ tintes sensibles como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 y Oregon Green BAPTA-1 realiza...

Los iones de calcio (Ca2 +) de forma ubicua regulan una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la expresión génica, la secreción y cambios de larga duración en la plasticidad sináptica 1. Una manera a través del cual Ca 2+ puede actuar de una manera tan diverso es a través de los diferentes patrones espaciales y temporales de Ca 2 + señales de una célula puede generar. Por ejemplo, elevaciones globales en citosólico [Ca 2 +] contracción de activación en el tejido muscular liso 2, mientras más pequeño, elevaciones transitorias localizadas (locales Ca 2+ microdominios) estimular la expresión esencial para el aprendizaje y la memoria 3 gen. Citosólico libre [Ca 2 +] se mantiene a ~ 100 nM en reposo, pero puede aumentar rápidamente a varios micro-molar después de la afluencia de Ca2 + en el citosol a través de canales de Ca2 + de iones permeables situados en la membrana plasmática y por la liberación de Ca2 + intracelular de stores. Nuestro laboratorio se centra en el inositol 1,4,5-trifosfato receptor (IP 3 R), que forma un canal de liberación de Ca 2+ situado en la membrana del retículo endoplasmático (ER). Tras la unión de ambos IP 3 y Ca 2+ a la citosólica sitios del receptor activador, el canal R IP 3 se abre para liberar Ca 2+ secuestrado dentro de la luz del RE. La liberación de Ca 2+ puede permanecer espacialmente restringida a un pequeño grupo de IP 3 Rs para generar un microdomain citosólica local del Ca 2+ (Ca 2+ puff 4) o, dependiendo de la proximidad de los grupos vecinos de IP 3 Rs, puede propagar en una célula mediante la contratación de varios sitios de hojaldre a través de un proceso de Ca2 + inducida por Ca 2 + de liberación (CICR) 5,6. La introducción de la pequeña molécula fluorescente Ca 2+ colorantes indicadores desarrollado por Roger Tsien 7, junto con la avanzada imagi microscopíang técnicas, ha facilitado en gran medida nuestra comprensión de Ca 2 + señalización. Los recientes avances en cámaras utilizadas para microscopía permiten ahora para obtener imágenes de transitorios de Ca2 + eventos locales, tales como soplos con resolución espacial y temporal sin precedentes. Actualmente cámaras EMCCD disponibles permiten imágenes de 128 x 128 píxeles a&gt; 500 marcos seg -1 (fps) y la nueva generación de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) cámaras proporcionan una mayor resolución de píxeles, y la velocidad aún más rápida a costa de un poco más alto los niveles de ruido. En conjunción con la reflexión interna (TIRF) microscopía total, ahora es posible de una sola imagen Ca 2+ eventos de canal 8,9. Este enfoque permite la obtención de imágenes de cientos de canales / eventos simultáneamente, mientras que la generación de grandes conjuntos de datos (ca. 1Gb por minuto) que hacen que el tratamiento manual, la identificación visual y análisis impracticable y colocan una responsabilidad en el desarrollo de algoritmos automatizados. 2 + señales en células de mamífero intactas usando Ca 2+ indicadores fluorescentes. Además, demuestran un algoritmo desarrollado en el entorno Python de código abierto que automatiza la identificación y el análisis de Ca 2+ eventos locales fotografiados por tanto TIRF y amplio campo epi-fluorescencia convencional (WF) microscopía. Aunque estos enfoques se describen en el contexto de IP 3 -generated Ca 2 + señales, que son fácilmente susceptibles de estudiar los cambios locales en citosólico [Ca 2 +] que emanan de una variedad de canales de Ca2 + de iones permeables situados en cualquiera de la superficie membrana o orgánulos intracelulares 8-10.

<table><tbody><tr><td>Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(D-23-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Isopropylidene-6-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom imaging dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Citosólica iones Ca2 + a regular diversos aspectos de la actividad celular en casi todos los tipos de células, el control de procesos tan diversos como la transcripción de genes, excitabilidad eléctrica y la proliferación celular. La diversidad y la especificidad de la señalización de Ca2 + se deriva de mecanismos por los que Ca 2 + señales se generan para actuar sobre diferentes escalas de tiempo y espaciales, que van desde las oscilaciones y las ondas de todo el celulares que ocurren durante los períodos de minutos a locales transitorias de Ca2 + microdominios (Ca 2+) bocanadas milisegundos duraderos. Los recientes avances en electrónica se multiplicaron CCD (EMCCD) cámaras permiten ahora para obtener imágenes de Ca 2 + señales locales con una resolución espacial de 128 x 128 píxeles a una velocidad de&gt; 500 marcos seg-1 (fps). Este enfoque es altamente paralelo y permite la monitorización simultánea de cientos de canales o de los sitios de hojaldre en un solo experimento. Sin embargo, las grandes cantidades de datos generados (aproximadamente 1 pe Gbr min) hacer la identificación visual y análisis de Ca 2+ local de eventos impracticable. Aquí describimos y demostrar los procedimientos para la adquisición, la detección y el análisis de IP local 3 mediada por Ca 2 + señales en células de mamífero intactas cargadas de Ca 2+ indicadores utilizando tanto de campo amplio epi-fluorescencia (WF) y la reflexión interna total fluorescencia (TIRF) microscopía. Además, se describe un algoritmo desarrollado en el entorno Python software de código abierto que automatiza la identificación y el análisis de estos Ca 2 + señales locales. El algoritmo localiza sitios de liberación de Ca2 + con resolución sub-pixel; permite la revisión de los datos de usuario; y emite secuencias de tiempo de señales de relación de fluorescencia junto con amplitud y datos cinéticos en una tabla compatible con Excel.

La figura 1A muestra una imagen WF de descansar Cal-520 fluorescencia en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y también cargados de ci-IP 3. La exposición de estas células a un flash 100 ms UV para foto-release i-IP 3 provocó transitorios de Ca2 + puffs en sitios discretos (señaladas por los círculos blancos en la figura 1A). Trazas fluorescencia medida en estos sitios mostraron una fase ascendente rápido debido a las aberturas transitorios de I...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K vistas.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

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Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Biología del Desarrollo

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Disección de Local Ca2 + señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca2 + indicadores

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Imágenes de calcio de monocapas de organoides intestinales humanos infectados por virus

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Autor destacado: Investigación de la interrupción viral de la señalización epitelial intestinal: perspectivas de investigación y direcciones futuras 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Inmunología e Infección

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

Visualización de cambios en el circuito Neuron-Glia con la técnica de imágenes de calcio

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

<meta charset="utf8"></head><body>Técnica de imagen de alta resolución para la detección de microdominiosCa-2+ en células T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Desentrañando la activación inicial de la respuesta inmunitaria adaptativa para la intervención terapéutica

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Obtención de imágenes de microdominios Ca2+ iniciales en células T primarias

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Imagen Ca Local

Resumen

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Capítulos en este video

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

Disección de Local Ca^{2 +} señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca^{2 +} indicadores

Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Visualización de cambios en el circuito Neuron-Glia con la técnica de imágenes de calcio

Obtención de imágenes de microdominios Ca²⁺ iniciales en células T primarias