Este nuevo protocolo permite al investigador monitorear múltiples parámetros metabólicos incluyendo oxigenación citosólica y mitocondrial, así como el estado de redox citosólico. Mientras se miden simultáneamente las mediciones tradicionales de la función miocárdica. La principal ventaja de esta técnica es un simple monitoreo dinámico no destructivo de elementos importantes del metabolismo mitocondrial en el corazón perfundido que evita los artefactos asociados con la espectroscopia de reflexión.
Aquellos nuevos en esta técnica pueden tener problemas con la inserción del catéter sin dañar la válvula y evitar la contaminación de la luz de la habitación. El catéter debe insertarse y ajustarse cuidadosamente. La fibra de recolección también debe colocarse correctamente para maximizar la luz transmitida a través de la pared libre ventricular izquierda que puede ser difícil.
Para comenzar a cortar una pequeña pieza del apéndice auricular izquierdo e insertar un catéter de fibra óptica en el ventrículo izquierdo a través de la válvula mitral. A continuación, gírelo para lograr una pared libre de ventrículo izquierdo iluminado. Conecte el otro extremo de la fibra de recogida a un espectrómetro de escaneo rápido.
Coloque la fibra óptica de recogida directamente frente a la región de iluminación máxima del ventrículo izquierdo a aproximadamente un centímetro del corazón. Las fuentes de luz de la habitación deben ser cero. La rotación del catéter y el posicionamiento de la fibra óptica de recogida deben ajustarse para obtener una luz adecuada sin saturación del detector.
Apague las luces en el área experimental para obtener una oscuridad completa. Inicie el programa personalizado incorporando controladores de espectrómetro para realizar la adquisición de datos y el análisis en tiempo real de la luz transmitida. Navegue a través de todas las solicitudes seleccionando opciones para el modo de adquisición de espectroscopia cardíaca perfundida.
En la página siguiente, indique si se está produciendo una recopilación de datos auxiliares. Por último, introduzca los parámetros de adquisición, incluida la ubicación de los espectros de referencia de cromóforo y los datos que se van a guardar. Ahora ingrese un ancho de banda de 490 a 630 nanómetros.
Introduzca una frecuencia de muestreo de dos hercios. Recoja una corriente oscura o un espectro de luz cero para corregir los niveles de señal de fondo apagando la fuente de luz. Haga clic para seleccionar las referencias de cromóforo deseadas que se utilizarán en la rutina de montaje.
En la página de datos de adquisición, ajuste la posición tanto del catéter como de la fibra de recogida para maximizar la luz transmitida que se muestra en el software con una atención específica a la amplitud de la señal en la región de 500 nanómetros donde se deben observar las absorbancias de mioglobina oxigenada. Asegúrese de que la luz transmitida no esté saturando el detector en la región de 600 nanómetros. Asegúrese de que no haya fuentes de luz externas que contribuyan al espectro recogido apagando la iluminación del catéter y confirmando que ahora no se detecta luz.
Inicie la recopilación de datos haciendo clic en el botón Guardar espectro. Haga clic en Establecer como control para ver el espectro de absorbancia de diferencia de espectros futuros en relación con el espectro de control actual. En este punto realizar cualquier perturbación fisiológica como se desee.
Por ejemplo, para determinar los efectos de la cianidina en el rendimiento cardíaco y la absorción de cromóforos, detenga la recirculación del perfuso para evitar el reciclaje de cianuro. Utilice una bomba de jeringa para inyectar cianuro a diferentes velocidades en el perfuso justo antes de la cánula aórtica para lograr las concentraciones deseadas de cianuro en el perfuso que fluye hacia el corazón. Supervise simultáneamente la función cardíaca y las propiedades ópticas.
Detenga la bomba de la jeringa de cianuro cuando los efectos del flujo coronario y la frecuencia cardíaca, junto con la transmisión óptica a través de la pared del corazón estén en estado estacionario. Cinco minutos después de detener la infusión de cianuro, cambie el gas burbujeante de 100% de oxígeno a 100% de nitrógeno para eliminar el oxígeno del sistema. Después de unos 10 minutos detener el flujo para simular una condición isquémica e hipoxica total.
Para el análisis de datos espectrales, ejecute el programa en el modo de análisis cardíaco perfundido. Seleccione el programa de análisis adecuado. Introduzca la ruta del archivo de datos y el archivo de espectro de referencia.
Seleccione la fuente de luz del catéter que cargue el espectro previamente guardado de la fuente de luz del catéter. Seleccione Leer datos de ubicación. A continuación, seleccione Establecer longitud de onda mínima y máxima.
Introduzca el ancho de banda para el análisis de datos como 490 a 630 nanómetros. Seleccione Volver al menú principal y, a continuación, seleccione Leer referencias. Confirme los espectros de referencia que se utilizarán en el análisis.
Seleccione Volver al menú principal y, a continuación, seleccione Puntos de tiempo en el menú principal. Ahora seleccione un punto de tiempo de tiempo cero como el control y establezca el rango en 100 puntos. Seleccione también un punto de tiempo de una vez como el período experimental en un rango de 100 puntos.
Observe el espectro de diferencia bruta en la pestaña Espectro de absorbancia promediada. Vuelva al menú principal y seleccione Calcular absorción de diferencias.
Seleccione el tiempo cero y la diferencia entre el tiempo cero y el tiempo una en todas las posiciones. Observe el espectro ajustado en la ventana de espectro diferente y los elementos de ajuste en la ventana de peso de referencia. Repita este procedimiento para comparar otros puntos de tiempo del experimento.
Vuelva al menú principal. Guarde los datos y el análisis en un informe de hoja de cálculo escribiendo el nombre deseado y seleccionando Guardar datos para su posterior análisis con otros programas. Aquí se muestra el espectro del catéter y el espectro crudo de la luz transmitida de la pared libre del corazón del conejo.
Estos datos revelan una atenuación muy grande de la luz en la región azul del espectro. Sin embargo, las bandas de absorbancia de la mioglobina y los citocromos mitocondriales se pueden observar directamente entre 490 y 580 nanómetros en la plaquita. Aquí se muestra el espectro de diferencia del control y del corazón tratado con cianuro.
El espectro de ajuste se calcula a partir de los espectros de referencia. El espectro residual es la resta del ajuste de los datos sin procesar. Aquí se muestran las amplitudes de espectro de los espectros de referencia.
Se observan fuertes aumentos en la absorbancia de la mayoría de los citocromos, ya que el flujo de electrones por la cadena del citocromo fue bloqueado por cianuro en estado estacionario. Además, la absorción de mioglobina oxigenada aumentó a medida que el consumo de oxígeno fue eliminado por cianuro. El espectro de diferencia del lavado de cianuro frente a la inyección de cianuro revela una reversión parcial del efecto cianuro.
Aquí se muestra el espectro de diferencias del estado de isquemia sin flujo frente al control. Este espectro representa el estado totalmente desoxigenado y reducido de la mitocondria citosolente verus la condición de control. Actualmente estamos estudiando los efectos del óxido nítrico en el metabolismo cardíaco.
Además de los mencionados cromóforos, también podemos rastrear otras especies ópticamente detectables incluidas metmyoglobina generadas por óxido nítrico. Además, el catéter se puede conectar a un láser para estudiar el metabolismo de los lípidos mediante espectroscopia raman. El metabolismo cardíaco de calcio también se puede estudiar mediante la absorción de sondas de calcio incorporadas exógenamente o genéticamente.
