Этот новый протокол позволяет исследователю контролировать несколько метаболических параметров, включая цитозоловую и митохондриальную оксигенацию, а также статус цитозолического редокса. При одновременном измерении традиционных измерений функции миокарда. Основным преимуществом этого метода является простой неразрушающий динамический мониторинг важных элементов митохондриального метаболизма в проникнутом сердце, что позволяет избежать артефактов, связанных с спектроскопией отражения.
Те, кто является новым для этой техники может бороться с вставкой катетера, не повреждая клапан и избежать загрязнения света комнаты. Катетер должен быть вставлен и тщательно отрегулирован. Волокно сбора также должно быть расположено должным образом, чтобы максимизировать свет, передаваемый через левую желудочковой свободной стенки, которые могут быть трудными.
Для начала вырезать небольшой кусочек левого предсердия придаток и вставить волоконно-оптический катетер в левый желудочек через митральный клапан. Затем поверните его, чтобы достичь освещенной левой стенки желудочка. Подключите другой конец волокна забрать для быстрого сканирования спектрометра.
Распоитить подбирать волоконно-оптические непосредственно напротив области максимального освещения левого желудочка примерно в одном сантиметре от сердца. Источники света в комнате должны быть нулевыми. Вращение катетера и позиционирование оптического волокна необходимо регулировать, чтобы получить адекватный свет без насыщения детектора.
Выключите свет в экспериментальной области, чтобы получить полную темноту. Запустите пользовательскую программу, включающая драйверы спектрометра для выполнения сбора данных и анализа передаваемого света в режиме реального времени. Перейдите через все подсказки выбора вариантов для проникнуты сердца спектроскопии приобретения режима.
На следующей странице укажите, происходит ли вспомогательный сбор данных. Наконец введите параметры приобретения, включая расположение как спектров ссылки хромофора, так и данных, которые будут сохранены. Теперь введите пропускную способность от 490 до 630 нанометров.
Введите скорость выборки из двух герц. Соберите темный ток или нулевой световой спектр, чтобы исправить уровни фонового сигнала, выключив источник света. Нажмите, чтобы выбрать нужные ссылки хромофора, которые будут использоваться в примерочной процедуре.
На странице данных о приобретении корректируются положение как катетера, так и волокна, чтобы максимизировать передаваемый свет, отображаемый на программном обеспечении, с определенным вниманием к амплитуде сигнала в области 500 нанометров, где следует наблюдать абсорбции миоглобина. Убедитесь, что передаваемый свет не насыщает детектор в области 600 нанометров. Убедитесь, что никакие внешние источники света не вносят вклад в собранный спектр, выключив катетерное освещение и подтвердив, что свет в настоящее время не обнаружен.
Инициировать сбор данных, нажав на кнопку Сохранить Спектры. Нажмите на Set as Control, чтобы просмотреть спектр абсорбтов разницы от будущих спектров относительно текущего спектра управления. На данный момент выполнять любые физиологические возмущения по желанию.
Например, чтобы определить влияние цианидина на работу сердца и поглощение хромофора, остановить рециркуляцию перфусата, чтобы избежать переработки цианида. Используйте шприц насос для введения цианида с разной скоростью в перфусировать незадолго до аорты канулы для достижения желаемых концентраций цианида в перфусации течет в сердце. Одновременно следите за сердечной функцией и оптическими свойствами.
Остановить цианид шприц насос, когда последствия коронарного потока и сердечного ритма, наряду с оптической передачи через стенку сердца находятся в стабильном состоянии. Через пять минут после остановки инфузии цианида переключитесь с 100%-ного кислорода на 100% азот для удаления кислорода из системы. Примерно через 10 минут остановить поток для имитации общего ишемического и гипоксического состояния.
Для анализа спектральных данных запустите программу в режиме анализа сердца. Выберите соответствующую программу анализа. Введите путь файла данных и файл эталонных спектров.
Выберите источник света катетера, который загружает предварительно сохраненный спектр источника света катетера. Выберите данные Read Bin. Затем выберите Набор Минимум и Максимальная длина волны.
Введите пропускную способность для анализа данных, как от 490 до 630 нанометров. Выберите Возвращение в основное меню, а затем выберите Ссылки На чтение. Подтвердите эталонный спектр для использования в анализе.
Выберите Возвращение в основное меню, а затем выберите очки времени в основном меню. Теперь выберите точку времени нулевого времени в качестве управления и установите диапазон до 100 пунктов. Также выберите время одно время точки в качестве экспериментального периода в диапазоне 100 точек.
Соблюдайте необработанный спектр различий во вкладке Средний абсорбанс Спектр. Выберите коэффициенты Calculate Fit, а затем нажмите на вкладку Fit Coefficients, чтобы наблюдать за течением времени ретроспективной подгонки. Вернитесь в основное меню и выберите Рассчитайте абсорбции разницы.
Выберите ноль времени и разницу между нулем времени и временем один на всех позициях. Соблюдайте установленный спектр в окне различного спектра и элементы установки в окне эталонного веса. Повторите эту процедуру, чтобы сравнить другие точки времени в эксперименте.
Вернитесь к основному меню. Сохранить данные и анализ в отчете электронной таблицы, введя нужное имя и выбрав Сохранить данные для дальнейшего анализа с другими программами. Здесь показан спектр катетера и необработанный спектр передаваемого света от стены, свободной от сердца кролика.
Эти данные свидетельствуют об очень значительном затухание света в синей области спектра. Тем не менее, полосы абсорбции от миоглобина и митохондриальных цитохромов можно непосредственно наблюдать между 490 и 580 нанометров в вставке. Разница спектра контроля и цианида обработанных сердце показано здесь.
Спектр соответствия рассчитывается из эталонных спектров. Спектр остатков – это вычитание подгонки из необработанных данных. Здесь показаны спектральные амплитуды эталонных спектров.
Сильное увеличение поглощения большинства цитохромов наблюдается, как поток электронов вниз цитохромной цепи был заблокирован цианидом в устойчивом состоянии. Кроме того, поглощение оксигенированного миоглобина увеличилось по мере того, как потребление кислорода было ликвидировано цианидом. Разница спектра от вымывания цианида по сравнению с инъекцией цианида показывает частичный разворот эффекта цианида.
Здесь показан спектр различий состояния ишемии без потока по сравнению с контролем. Этот спектр представляет собой полностью дезоксигенированное и пониженное состояние цитозентных митохондрий verus контрольное состояние. В настоящее время мы изучаем влияние оксида азота на сердечный метаболизм.
В дополнение к вышеупомянутым хромофорам мы также можем отслеживать другие оптически обнаруживаемые виды, включая метмиоглобин, генерируемый оксидом азота. Кроме того, катетер может быть подключен к лазеру для изучения метаболизма липидов с помощью раман-спектроскопии. Метаболизм кальция сердца также может быть изучен путем поглощения кальция зонды включены экзогенно или генетически.
